Введение
2. Литературный обзор 9
2.1. История исследования лакказ 9
2.2. Распространение в природе и физиологические функции лакказ 10
2.3. Общая характеристика лакказ 14
2.4. Структура и строение активных центров лакказ 17
2.5. Субстратная специфичность лакказ 22
2.6. Механизмы катализа 25
2.7. Биосинтез лакказ 29
2.8. Использование лакказ в биотехнологии 30
2.9. Геномная организация лакказ 36
2.10. Экспрессия грибных лакказ 42
3. Материалы и методы 50
3.1. Материалы 50
3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты 50
3.1.2. Носители 50
3.1.3. Реагенты 50
3.2 Методы 52
3.2.1 Культивирование штаммов продуцентов лакказы 52
3.2.2 Получение антигена - дегликозилированной лакказы (Lacl) 53
3.2.3 Иммунизация 54
3.2.4 Тестирование антисывороток методом непрямого ИФА 54
3.2.5 Измерение пероксидазной активности в твердофазных системах... 55
3.2.6 Очистка поликлональных антител 55
3.2.7 Определение специфичности полученных препаратов антител 56
3.2.8 Синтез конъюгатов, меченых пероксидазой хрена (ПХ) 56
3.2.9 Вестерн блоттинг 57
3.2.10 Выделение рекомбинантной лакказы 57
3.2.11 Определение активности лакказы 58
3.2.12 Определение концентрации белка 58
3.2.13 Оценка гомогенности препаратов и определение молекулярной массы 58
3.2.14 Определение изоэлектрической точки 58
3.2.15 Спектральная характеристика 58
3.2.16 Регистрация ЭПР-спектров лакказы 59
3.2.17 Определение количества углеводов 59
3.2.18 Определение температурного и рН-оптимумов активности лакказ и изучение их термостабильности 59
3.2.19 Дифференциальная сканирующая калориметрия 60
3.2.20 Определение кинетических параметров 60
3.2.21 Подбор и оптимизация условий кристаллизации рекомбинантной лакказы 61
3.2.22 Сбор кристаллографических данных и их обработка 62,
3.2.23 Визуализация белковых структур 62
3.2.24 Динамическое светорассеяние 62
3.2.25 Расчет модели взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТ 62
4. Результаты и их обсуждение 50
4.1. Разработка метода иммунодетекции лакказ 66
4.2. Выделение нативной и рекомбинантной лакказ 71
4.3. Изучение спектральных характеристик лакказ 77
4.4. Сравнительная характеристика физико-химических свойств нативного и рекомбинантного ферментов 80
4.4.1 рН-оптимум 80
4.4.2 Термооптимум 81
4.4.3 Термостабильность 82
4.4.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДОС) 83
4.5 Каталитические свойства рекомбинантной лакказы 84
4.6 Сравнительное изучение трехмерных структур рекомбинантной лакказы из P. canescens и нативной лакказы из Т. hirsuta 87
4.6.1 Решение и уточнение структуры рекомбинантной лакказы 87
4.6.2 Сравнение последовательностей нативной и рекомбинантной лакказ. 89
4.6.3 Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ 90
4.6.4 Сравнение активного центра нативной и рекомбинантной лакказ... 94
4.6.5 Образование димерной формы 98
4.6.6 Расчетная модель взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС 100
5. Выводы 64
6. Список литературы 107
