Введение
1. Генетические различия между человеком и высшими приматами 7
1.1. Сравнение геномных последовательностей 7
1.2. Структурные различия в геноме митохондрий 12
1.3. Цитогенетические различия 13
1.4. Различия в структуре и распределении повторяющихся элементов генома 16
1.4.1. SINE и LINE элементы 17
1.4.2. Эндогенныеретровирусы 21
1.5. Различия в структуре и уровне экспрессии кодирующих последовательностей 23
1.5.1. Случаи инактивации генов. 23
1.5.2. Дупликации генов 25
1.5.3. Полиморфизмы 29
1.5.3.1. Мононуклеотидные полиморфизмы (SNP) 30
1.5.4. Различия в структуре генов -. 31
1.5.5. Различия в статусе метилирования генов 34
1.5.6. Различия в уровне экспрессии генов 35
1.6. Сравнение свойств белков человека и шимпанзе 40
1.7. Заключение 41
2. Сравнение мРНК мозга человека и шимпанзе 43
2.1. Вычитающая гибридизация кДНК из мозжечков человека и шимпанзе 44
2.1.1. Выделение и характеристика суммарной РНК из мозжечков человека и шимпанзе 44
2.1.2. Вычитающая гибридизация. Отбор дифференциальных клонов 45
2.1.3. Дифференциальная гибридизация. Отбор и идентификация дифференциальных транскриптов 47
2.1.4. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК дифференциальных клонов 48
2.1.5. Идентификация клонов, содержащих вставки последовательностей митохондриальных кДНК. 49
2.1.6. Анализ последовательностей кДНК немитохондриальной природы 52
2.1.7. Анализ гена KIAA0537 52
2.2. Структурно-функциональный анализ гена транстиретина 53
2.2.1. Сравнение последовательностей мРНК транстиретина человека и шимпанзе 54
2.2.2. Сравнительный анализ уровня транскрипции гена транстиретина в отделах мозга человека и шимпанзе 57
2.2.3. Тканеспецифичность транскрипции гена транстиретина в разных отделах эмбрионального мозга человека 60
2.2.4. Сравнительный анализ областей регуляции гена транстиретина в геномах мыши, человека и шимпанзе 62
2.2.5. Попытки экспериментальной идентификации регуляторних последовательностей 5-прилегающей области гена транстиретина человека 67
2.2.6. Попытки идентификации последовательностей гена TTR человека, связывающихся с белками ядерных экстрактов 71
2.2.7. Анализ связывания последовательностей гипотетических энхансеров гена TTR человека и шимпанзе с белками ядерных экстрактов клеточных линий HepG2 и Z310 74
3. Экспериментальная часть 77
Оборудование 77
Реактивы и ферменты 78
Среды, буферы, растворы 79
Ткани 81
Штаммы, культуры, плазмиды 83
Клеточные линии 83
Ядерные экстракты 83
Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР 83
Методы 86
Выделение РНК из тканей гуанидин изотиоцианатным методом 86
Синтез первых цепей кДНК на матрице суммарной РНК 87
Вычитающая гибридизация кДНК 88
Дифференциальный скрининг вычтенных библиотек 88
Дифференциальная гибридизация 89
Определение первичной структуры ДНК. 90
RT-PCR 90
Определение активности энхансеров 5-прилегающего участка гена транстиретина человека 91
Связывание меченых фрагментов с белками ядерного экстракта 93
Метод двумерного торможения в геле (Треугольник) 94
Программное обеспечение 96
Выводы 97
