Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Метод SELEX 14
1.1.2. Укороченные аптамеры 21
1.1.3. Сравнение свойств антител с аптамерами
1.2. Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях 26
1.3. Аптамеры к антибиотикам
1.3.1. Аптамеры к тетрациклину 32
1.3.2. Аптамеры к стрептомицину 35
1.3.3. Аптамеры к хлорамфениколу 37
1.3.4 Аптамеры к аминогликозидам 39
1.4. Аптамеры как биосенсоры 39
1.5.Свойства аптамеров, ингибирующих биологическую активность белков 42
1.6. Аптамеры к белкам, не связывающим нуклеиновые кислоты 47
1.6.1. Аптамеры к тромбину 47
1.6.2. Аптамеры к фактору Vila 57
1.6.3. Аптамеры к фактору 1Ха 58
1.6.4. Аптамеры к протеиназе вируса гепатита С - NS3 (HSV-NS3) 61
1.6.5. Аптамеры к эластазе нейтрофилов человека 62
1.6.6. Аптамеры к VEGF 63
1.6.7. Аптамеры к основному ростовому фактору фибробластов 67
1.6.8. Аптамеры к ростовому фактору PDGF 68
1.6.9. Аптамеры к интерферону у человека
1.6.10. Аптамеры к ангиопоэтину-2 70
1.6.11. Аптамеры к белкам вируса гриппа 70
1.7. Аптамеры к белкам, связывающим нуклеиновые кислоты
1.7.1. Аптамеры к Tat-белку 72
1.7.2. Аптамеры к HIV-1 Rev (ревертаза) 74
1.7.3. Аптамеры к ШУ обратной транскриптазе 74
1.7.4. Транскрипционный фактор E2F 75
1.7.5 Аптамеры к фактору NF-kB 77
1.8. Аптамеры к антителам, к иммуноглобулинам 78
1.8.1. Аптамеры к антителу МА20 к инсулиновому рецептору 78
1.8.2. Аптамеры к моноклональному антителу (Mab) к ацетилхолиновому рецептору 79
1.8.3.Аптамеры к иммуноглобулину Е 80
1.8.4.Аптамеры к цитотоксичному антигену Т4 81
1.9.Аптамеры к адгезивным молекулам 81
1.9.1.Аптамеры к Р-Селектину 81
1.9.2.АптамерыкЬ-селектину 82
1.10.Аптамеры к антигену PSMA 83
1.11-Аптамеры к белкам комплемента С5 человека 83
1.12.Аптамеры к липопротеинам (не-панкреатическая секреторная фосфолипаза А2 человека 84
ЫЗ.Аптамеры к прионовым белкам -PrPsc 84
1.14.Аптамеры к патогенам (к трипанозоме) 85
2. Результаты и обсуждение 87
2.1. Компьютерная аннотация зоны контакта белка TthS7 с Tth 16S рРНК в составе Tth30S, компьютерное моделирование третичной структуры белка EcoS7 87
2.2. Изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком S7 прокариот
2.2.2. Создание суперпродуцентов рибосомных белков S7 из различных организмов: Escherichia coli (EcoS7), Thermus thermophilus (TthS7).
Отработка методов сворачивания белковой молекулы 92
2.2.3. Изучение комплексообразование рибосомных белков S7 из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilus (TthS7) с фрагментами 16S pPHK Е. coli и делеционными фрагментами strмРНК Е. coli 94
2.2.3.1. Взаимодействие фрагмента Ecol6S pPHK с белками EcoS7, TthS7 95
2.2.3.2. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента Ecol6SpPHK 98
2.2.3.3. Взаимодействие фрагмента EcoStr мРНК с белками EcoS7 и TthS7 99
2.2.3.4. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента
EcoStr мРНК 104
2.2.4. Делеционный анализ strMPHKii. Coli 106
2.2.5. Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона str мРНК Е. coli с белками EcoS7 и TthS7 108
2.2.6. Селекция аптамеров РНК на основе фрагмента EcoStr мРНК 109
2.2. Создание аптамерных ДНК к тромбину, обладающих стабильной пространственной структурой и способностью связывать тромбин с высокой эффективностью и специфичностью in vitro. Оценка эффективности ингибирующего действия аптамеров на активность тромбина в реакциях фибринолиза и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro 114
2.2.1. Создание ДНК-аптамеров к тромбину 117
2.2.2. Компьютерное моделирование структур ДНК-аптамеров 118
2.2.3. Изучение ДНК-аптамеров методом кругового дихроизма 121
2.2.4. Комплексы ДНК-аптамеров с тромбином 129
2.2.5. Изучение взаимодействия аптамера RE31 с тромбином методом плазмонного резонанса (ППР) 134
2.2.6. Тромбин - ключевой белок свертывания крови 136
2.2.7. Ингибирование процессов свертывания крови ДНК-аптамерами 141
2.2.8. Влияние мутантного аптамера на процесс свертывания крови 144
2.2.9. Влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов 144
2.3.Создание модифицированных производных аптамеров. Оценка эффективности ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo 146
2.3.1. Свойства модифицированных аптамеров 147
2.3.2. Действие модифицированных аптамеров на тромбин индуцированную агрегацию тромбоцитов 149
2.3.3.Изучение влияния ДІЖ-аптамеров на коагуляционнуїо способность плазмы крови на животных моделях 150
2.3.4. Оценка ингибирующего действия модифицированных аптамеров на модели артериального тромбоза in vivo 152
2.4. Создание антидота к аптамерной ДНК. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин 153
2.4.1. Структура антидота 154
2.4.2. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин 155
3. Материалы и методы 157
3.1. Программы и схемы, использованные при компьютерном моделировании рибосомного белка EcoS7 158
3.2. Клонирование рибосомных белков
3.2.1. Клонирование TthS7 159
3.2.2. Клонирование EcoS7 159
3.3. Подготовка компетентных іслеток и трансформация рекомбинантными плазмидами 160
3.4. Определение наличия вставки в векторе 161
3.5. Выделение рибосомных белков EcoS7 TthS7 161
3.6. Синтез РНК in vitro с фрагментов ДНК, полученных ПЦР 164
3.7. Выделение фрагмента 16S рРНК и фрагментов EcoStr мРНК Е. coli 165
3.8. Работа с комбинаторной библиотекой РНК 166
3.9. Комплексообразование РНК с рибосомным белком
3.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК через секвенирование ДНК по Сэнгеру 167
3.11. Реакции радиоактивного мечения олигодезоксирибонуклеотидов 168
3.12. Химическая модификация РНК 168
3.13. Картирование модификаций и расщепления РНК, а также контрольное секвенирование 169
3.14. УФ - индуцируемое «сшивание» комплекса РНК с белком 170
3.15. Иммобилизация тромбина на CNBr-активированной сефарозе 170
3.16. Работа с комбинаторной библиотекой ДНК 171
3.17. Анализ фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле 173
3.18. Разделение цепей ДНК с помощью стрептавидиновых частиц 173
3.19. Селектирование аптамеров к тромбину первым способом 174
3.20. Селекция аптамеров ктромбину вторым способом 174
3.21. Определение степени комплексообразования ДНК с тромбином 176
3.22. Рестрикция нуклеиновых кислот 176
3.23. Лигирование обогащенной фракции аптамеров с плазмидными ДНК 177
3.24. Секвенирование аптамеров в составе плазмид 177
3.25. Дизайн и структура базовых ДНК-аптамеров, взаимодействующих с тромбином 178
3.26. Аптамеры к тромбину 179
3.27. Исследования структур аптамеров с помощью метода кругового дихроизма 181
3.28. Работа с тромбином 182
3.29. Методика исследования связывания аптамеров с тромбином 184
3.30. Иммобилизация аптамера RE31 185
3.31 Модель артериального тромбоза у животных 186
Выводы 188
Список литературы 191
Приложение
