Введение
2 Оболочечные белки вируса гепатита С и перспективы создания вакцины 12
2.1. Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С 12
2.2.Экспериментальные модели для изучения вируса гепатита С 18
2.3.Молекулы на поверхности клетки-хозяина - предполагаемые рецепторы
для вируса гепатита С 25
2.3.1. Липопротеины низкой и очень низкой плотности и их рецепторы 25
2.3.2. SR-B1 и CD81 в качестве рецепторов для вируса гепатита С 27
2.3.3. Асиалогликопротеиновый рецептор 30
2.3.4. Лектины DC-SIGN и L-SIGN 32
2.3.5. Гликозаминогликаны 35
2.4.Структура и функции оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С .37
2.4.1. Общая характеристика структуры оболочечных белков 37
2.4.2. Вариабельность оболочечных белков 39
2.4.3. Структура и функции трансмембранных доменов оболочечных белков Е1иЕ2 43
2.4.4. Образование дисульфидных связей и фолдинг оболочечных белков Е1 иЕ2 46
2.4.5. Влияние гликозилирования оболочечных белков на их структуру и функции 48
2.4.6. ГетеродимерЕ1Е2 51
2.4.7. Образование вириона и высвобождение вирусной частицы во внеклеточное пространство 52
2.4.8. Участки оболочечных белков, ответственные за распознавание возможных рецепторов вируса гепатита С 53
2.4.9. Влияние оболочечных белков на регуляцию биосинтеза белков клетки-хозяина 55
2.5.Антигенные свойства оболочечных белков вируса гепатита С 57
2.6.Перспективы создания вакцины против вируса гепатита С 61
2.7.3аключение 65
3 Материалы и методы 66
3.1 Химические реагенты и биологические препараты 66
3.2 Растворители 68
3.3 Оборудование и программное обеспечение 68
3.4 Методы 70
3.4.1 Синтез пептидов 70
3.4.1.1 Снятие Fmoc-защиты cN-концевой аминогруппы 70
3.4.1.2 Присоединение Fmoc-защищенных аминокислот к свободным аминогруппам на иглах 71
3.4.1.3 Ацетилирование N-концевых ос-аминогрупп пептидов 72
3.4.1.4 Биотинилирование N-концевых а-аминогрупп пептидов 72
3.4.1.5 Снятие защит с боковых групп аминокислотных остатков пептида и снятие пептида в раствор пептидов с полимерного носителя 72
3.4.1.6 Восстановление сульфоксидных групп пептида 74
3.4.2 Тестирование биотинилированных пептидов на взаимодействие с гепарином 74
3.4.3 Конъюгация пептидов с белками-носителями 75
3.4.3.1 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием глутарового альдегида 75
3.4.3.2 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием N- гидроксисукцинимидного эфира 3-малеимидобензойной кислоты76
3.4.3.3 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием диметилсуберимидата 76
3.4.3.4 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием 1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимид 76
3.4.3.5 Качественная и количественная характеристика конъюгатов 77
3.4.4 Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов от иммунизированных животных 77
3.4.5 Тестирование сывороток методом иммуноферментного анализа 79
3.4.5.1 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета синтетических пептидов или конъюгатов пептидов 79
3.4.5.2 ИФА с использованием на поверхности планшета в качестве антигена синтетических биотинилированных пептидов 81
3.4.5.3 ИФА с использованием в качестве антигена пептида, ковалентно связанного с поверхностью планшет 81
3.4.5.4 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета оболочечного белка Е2 и гетеродимераЕ1Е2 82
3.4.5.5 Конкурентный иммуноферментный анализ 83
4 Результаты и их обсуждение 84
4.1 Составление структурно-функциональной карты оболочечных белков ВГС 84
4.2 Поиск гликозаминогликан-связывающих участков в высококонсерватив- ных фрагментах оболочечных белков ВГС 92
4.3 Изучение антигенных свойств высококонсервативных фрагментов оболо- чечных белков ВГС 98
4.3.1 Выбор высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС для изучения антигенной активности и синтез соответствующих им пептидов 98
4.3.2 Получение синтетических конструкций, включающих ВКФ для иммунизации животных 103
4.3.3 Получение антипептидных антител к фрагментам CR3, CR4, CR5 и CHR у кроликов . 109
4.3.4 Получение антипептидных антител к фрагментам CR1, CR5 и CHR у мышей 113
4.3.5 Определение специфичности антипептидных антител к препаратам оболочечных белков ВГС 119
4.4 Получение синтетических пептидных Т-В эпитопных конструкции на основе высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС. 121
4.4.1. Синтез Т-В эпитопных конструкций 121
4.4.2. Получение антител к Т-В-эпитопным конструкциям и определение их специфичности 122
4.4.3. Взаимодействие анти Т-В-эпитопных антител с препаратами оболочечных белков ВГС 128
4.5 Заключение 130
5 Выводы 133
6 Список литературы 134
7 Приложение 168
