Введение
I. Сравнительная характеристика дуоденазы и химаз, ферментов, структурно родственных химазоподобной протеазе (литературный обзор) 7
1. Дуоденаза, сериновая протеаза эпителиоцитов бруннеровых желез 7
1.1. Локализация и предполагаемая биологическая роль дуоденазы 7
1.2. Молекулярные свойства и структура дуоденазы 9
1.3. Энзиматические свойства дуоденазы 13
2. Химазы тучных клеток 17
2.1. Гетерогенность и биологическая значимость тучных клеток 17
2.2. Тканевая локализация и молекулярные свойства химаз 21
2.3. Структурные особенности химаз 25
2.4. Упаковка и хранение химаз в секреторных гранулах 30
2.5. Активация предшественников химаз 34
2.6. Субстратная специфичность химаз 35
2.6.1. Синтетические субстраты 35
2.6.2. Полипептидные и белковые субстраты 36
2.7. Ингибиторы химаз 41
2.7.1. Синтетические ингибиторы 41
2.7.2. Природные ингибиторы химаз 42
2.8. Физиологическая роль химаз 48
II. Результаты и обсуждение 53
1. Очистка фермента 54
2. Критерии чистоты и молекулярные свойства фермента 58
3. Стабильность фермента 63
4. N-концевая последовательность СЫР 63
5. Влияние рН, температуры и ионной силы на активность фермента 66
6. Субстратная специфичность ChIP 68
6.1. Синтетические субстраты 68
6.2. Природные полипептидные субстраты 71
7. Ингибиторный анализ 76
8. Иммунногистохимическая локализация ChIP 79
III. Экспериментальная часть 85
1. Материалы 85
2. Методы 86
2.1. Очистка химазоподобной протеазы 86
2.2. Определение белка 87
2.3. Определение активности 87
2.4. Определение концентрации фермента 88
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов 88
2.6. Гидролиз белков и пептидов ChIP 89
2.7. Масс-спектрометрический анализ 90
2.8. Гель-электрофорез 91
2.9. Аналитические методы определения ChIP 91
2.10. Определение рН-зависимости ChIP 92
2.11. Ингибирование ChIP 92
2.12. Определение N-концевой последовательности белка 93
2.13. Получение антител к ChIP 93
2.14. Иммуногистохимический анализ 93
Выводы 95
Список литературы 96
Список сокращений 123
