Введение
3. Обзор литературы. основные сенсоры воспалительных реакций и реакций врожденного иммунитета 8
3.1 TOLL-подобные рецепторы. 9
3.1.1 Структура 9
3.1.2 Лиганды TLR 10
3.1.3 Экспрессия TLR и чувствительность к стимуляции лигандами TLR различных субпопуляций мышиных В-клеток . 14
3.1.4 Клеточные мишени стимуляции TLR в человеческих В-клетках 16
3.1.5 TLR-индуцированная секреция цитокинов В-лимфоцитами. 16
3.1.5 Влияние на дифференцировку Т-клеток посредством TLR активации в антиген-презентирующих клетках (APC). 17
3.1.6 Прямая активация TLR в CD4+ T-эффекторных клетках индуцирует констимуляцию 19
3.1.7Влияние направленной TLR-активации на регуляционные T-клетки (Treg). 21
3.1.8 Адъювантная активность 22
3.2 БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА NLR. 24
3.3 БЕЛОК YB-1 35
3.3.1 Структура белка YB-1 35
3.3.2 Участие белка YB-1 в воспалительных заболеваниях 37
3.3.3 Участие белка YB-1 в онкогенезе 39
4. Методическая часть. 41
4.1 Реактивы и реагенты 41
4.2 Среды и растворы 43
4.3 Cтруктура праймеров 43
4.4 Штаммы E. coli и клеточные линии 44
4.5 Методика тестирования адъювантной активности RN-пептида 44
4.6 Выделение мононуклеарных клеток. 45
4.7 Измерение продукции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека 45
4.8 Выделение РНП 46
4.9 Выделение полисом, синтезирующих белки с высоким сродством к RN-пептиду. 46
4.10 Синтез КДНК 47
4.11 Амплификация ДНК 47
4.12 Рестрикция кДНК и лигирование с вектором 48
4.13 Лигирование 48
4.15 Получение электрокомпетентных клеток E. coli 48
4.16 Электропорация 49
4.17 Первичный анализ библиотеки методом скрининга на чашках 49
4.18 Выделение плазмиды 50
4.19 Рестрикция 51
4.20 Получение одноцепочечных Fv фрагментов антител (scFv) против YB-1 51
4.21 Определение Kd 52
4.22 Конкурентный анализ связывания RN-пептида и ГМДП с YB-1 52
4.23 Western блот 53
4.24 Выделение РНК с помощью Тrizol 53
4.25 Измерение уровня экспрессии NF-KB2. 54
4.26 Получение поликлональных антител против NOD2. 54
4.27 Получение мышиных моноклональных антител к белку YB-1. 55
4.28 Подготовка дендритных клеток костного мозга. 56
4.29 Определение внутриклеточной локализации YB-1 и NOD2. 56
5. Результаты и обсуждениe 58
5.1 Определение структур RN-пептида, необходимых для проявления биологической активности с помощью укороченных вариантов RN-пептида 61
5.2 Данные Ala-scan и проверка адъювантной активности 62
5.3 Анализ адъювантной активности RN-пептида 66
5.4 Индукция секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека RN-пептидом и ГМДП в разных концентрациях 67
5.5 Поиск белка, взаимодействующего с ГМДП 69
5.6 Данные анализа первичной структуры. 73
5.7 Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа 76
5.8 Изменение уровня экспрессии белков NFkB1, NFkB2 и NOD2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду 82
5.9 Анализ внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2 84
6. Выводы: 88
7. Список литературы 89
