Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Роль пилей первого типа в экологии микроорганизмов 12
1.1.1. Адгезии FimH как представитель класса лектинов 12
1.1.2. Роль пилей первого типа в адаптации микроорганизмов 13
1.1.3. Пили первого типа в историческом аспекте 14
1.2. Современные представления о пилях первого типа Е. coli 16
1.2.1. Морфология и структура пилей первого типа
1.2.2. Структурные компоненты пилей первого типа 17
1.2.3. Генетическая структура //m-кластера. Строение, функция отдельных генов в функционировании кластера
1.2.4. Регуляция экспрессии пилей первого типа 20
1.2.5. Биогенез фимбрии: секреция и процессинг субъединиц, сборка органеллы
1.2.6. Варианты рецепторной специфичности адгезина FimH 23
1.3. Структурно-функциональные свойства пилей первого типа 25
1.3.1. Фенотипическая гетерогенность FimH штаммов Е. coli. Взаимодействие с фибронектином.
1.3.2. Три варианта адгезивного фенотипа FimH. 26
1.3.3. Количественные разновидности в пределах М-фенотипа 28
1.3.4. Количественные различия, возникающие за счет вариабельной способности связываться с одиночными маннозильными остатками
1.4. Роль вариантов FimH в тканевом тропизме 31
1.4.1. Прочность фиксации на Ман-БСА коррелирует с результатами модельных опытов на уроэпителиальных клетках
1.4.2. Варианты FimH и количественные различия в связывании с З
ассиметричными участками мембран уроэпителия in situ
1.4.3. Варианты FimH, отличные по способности Е. соН 33 колонизировать мочевой пузырь мыши in vivo
1.4.4. Мутации FimH, повышающие уровирулентность, 34 препятствуют адгезии к клеткам орофарингеального эпителия
1.5. Варианты FimH и эволюция вирулентности 36
1.5.1. Филогенетический анализ аллелей FimH 36
1.5.2. Патоадаптивные мутации 38
1.5.3. Значение и перспективы дальнейшего изучения адгезина 40 FimH пилей первого типа
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и конструкции 42 гибридов
2.2. Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе 44
2.2.1. Среды 44
2.2.2. Антибиотики 44
2.2.3. Реактивы 44
2.3. Методы исследования бакгериальной адгезии 45
2.3.1. Исследование агрегации дрожжей 45
2.3.2. Исследование агглютинации эритроцитов 46
2.3.3. Исследование роста (Growth assay, ИР) 46
2.3.4. Обогащение культуры микроорганизмов 48
2.3.5. Радионуклеотидное исследование адгезии 48
2.3.6. Исследование адгезии к клеткам защечного эпителия. Инвертированное исследование адгезии
2.3.7. Исследование адгезии к эритроцитам в условиях непрерывного потока
2.3.8. Исследование адгезии к уроэпителиальным клеткам 53
2.4. Иммунологические методы 54
2.5. Методы работы с ДНК. 55
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК 55
2.5.2. Обработка ДНК 55
2.6. Методы введения генетического материала в клетку 57
2.6.1. Классическая (кальциевая) трансформация клеток E.coli ДНК
2.6.2. Электропорация 57
2.7. Метод управляемой молекулярной динамики 60
2.8. Математическая и статистическая обработка данных 61
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 62
3.1. Сравнительный анализ адгезивных вариантов FimH штаммов кишечной палочки. Выявление нового адгезивного фенотипа пилей первого типа.
3.1.1. Биологическая значимость структурно-функционального анализа адгезина FimH
3.1.2. FimH-FocH гибриды и их связывание с олиго- и мономаннозными рецепторными субстратами
3.1.3. Чувствительность связывания с РНКазойБ и 1М-БСА к ингибированию метил-а-О-маннопиранозидом
3.1.4. Свойства гибридных FimH-FocH адгезинов при взаимодействии с эукариотическими клетками
3.1.5. Определение конфигурации рецептор-связывающего сайта 1 М-специфического адгезина.
3.1.6. Индуцирование 1М фенотипа FimH точечной мутацией 78
3.1.7. Проверка морфологии пилей первого типа и экспрессии FimH мутантным клоном MS260
3.1.8. Новый адгезивный фенотип для понимания роли 83
фенотипической гетерогенности FimH
3.2. Изучение адгезивных свойств пилей первого типа штаммов Escherichia coli в условиях потока
3.2.1. Физиологический смысл рецептор-специфической адгезии бактерий
3.2.2. Реакция агглютинации эритроцитов в статических и динамических условиях
3.2.3. Связывание эритроцитов в камере непрерывного потока в зависимости от приложенной силы потока
3.2.4. Моделирование конформационных изменений структуры FimH, вызванных приложенной силой
3.2.5. Экспериментальное подтверждение корректности управляемого компьютерного моделирования
3.2.6. Функциональное значение адгезии, усиливаемой потоком 103
Заключение 107
Выводы 110
Список литературы
