Введение
2. Литературный обзор 8
2.1. Медьсодержащие оксидазы 8
2.1.1. Аскорбатоксидаза 10
2.1.2. Церулоплазмин 12
2.1.3. Лакказа 15
2.2. Структура медных центров 19
2.3. Спектральные свойства ионов меди 24
2.3.1. Предполагаемый механизм катализа у лакказ 26
2.4. Структурная организация медьсодержащих оксидаз 31
2.4.1. Доменная организация медьсодержащих оксидаз 31
2.4.2. Структуры лакказ 34
2.5. Геномная организация лакказ 37
2.5. ГИзоферменты лакказ 37
2.5.2. Экзон-интронная организация гена лакказ 39
3. Материалы и методы исследования 42
3.1. Материалы 42
3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты 42
3.1.2. Носители 42
3.1.3. Реагенты 42
3.2. Методы исследования 43
3.2.1. Культивирование штаммов продуцентов лакказы 43
3.2.2. Выделение хромосомной ДНК 44
3.2.3. Проведение ПНР 44
3.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле 45
3.2.5. Очистка ПЦР-продуктов 45
3.2.6. Рестрикция ДНК 46
3.2.7. Лигирование ДНК 46
3.2.8. Секвенирование ДНК 47
3.2.9. Математическая обработка данных секвенирования 47
3.2.10. Компьютерное моделирование 47
3.2.11. Визуализация белковых структур 47
3.2.12. Выделение и очистка лакказы 47
3.2.12.1. Очистка фермента методом ВЭЖХ 48
3.2.12.2. Очистка фермента методом изоэлектрофокусировапия 48
3.2.12.3. Очистка фермента методом препаративного электрофореза 49
3.2.13. Контроль гомогенности препаратов 49
3.2.14. Определение активности лакказы 49
3.2.15. Определение концентрации белка 50
3.2.16. Выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей лакказ 50
3.2.17. Получение кристаллов лакказы 50
3.2.18. Сбор кристаллографических данных и их обработка 51
4. Результаты и их обсуждение 52
4.1. Определение наличия гена лакказы в геноме базидиальных грибов 52
4.2. Определение аминокислотной последовательности лакказы C.hirsutus клонированием гена с хромосомной ДНК 55
4.2.1. Конструирование и синтез праимеров для клонирования лакказы из C.hirsutus 55
4.2.2. Оптимизация условий проведения ПЦР 59
4.2.3. Оптимизация конструкций новых олигонуклеотидных праймеров для клонирования лакказы из C.hirsutus 61
4.2.4. Получение полных нуклеотиднои и аминокислотной последовательностей лакказы C.hirsutus 63
4.3. Определение полной аминокислотной последовательности высоко редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea 66
4.4. Определение аминокислотной последовательности средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus 72
4.5. Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea 75
4.6. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ 79
4.7. Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ 80
4.8. Определение видовой принадлежности базидиальных грибов 84
4.9. Структурные исследования лакказ 86
4.9.1. Структуры лакказы C.hirsutus 86
4.9.2. Структуры лакказ C.maxima, C.zonatus 88
4.9.3. Моделирование структур лакказ P.ostreatus и C.fulvocinerea 89
4.10. Анализ аминокислотного окружения ТІ центра лакказ 90
4.13. Анализ второй координационной сферы иона меди ТІ 95
5. Выводы 99
6. Список литературы
