Введение
II. Обзор литературы 8
П.1. Структура и функции 8НЗ-доменов 8
II. 1.1. Общая характеристика БНЗ-доменов 8
II. 1.2. Структура 8НЗ-доменов 9
II. 1.3. Спектриновый SH3-домен дикого типа и его варианты 12
П.2. Структурные и термодинамические особенности р-шпилек в изолированном виде и в составе 8НЗ-доменов 16
П.2.1. Принципы организации изолированной Р-структуры 16
П.2.2. Химерные формы спектринового SH3-домена типа «Бержерак» 20
II.3. Анализ структуры комплексов 8НЗ-доменов с лигандами 22
11.3.1. Полипролиновая спираль И 22
11.3.2. Взаимодействие БНЗ-доменов с полипролиновыми пептидами 23
П.3.3. Способность БНЗ-доменов связывать полипролиновые спирали в двух ориентациях 25
П.3.4. Энергетика связывания пептидных лигандов SH3-доменами 27
III. Материалы и методы 31
III. 1. Материалы 31
III. 1.1. Химические реактивы, приборы 31
III. 1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды 33
III.2. Методы 34
Ш.2.1. Методы генной инженерии и микробиологии 34
Ш.2.2. Биохимические методы 38
Ш.2.3. Кристаллизация белков и сбор дифракционных данных 41
Ш.2.4. Спектроскопия ЯМР 43
Ш.2.5. Физические методы исследования 45
ПІ.2.5.1. Анализ данных сканирующей калориметрии и проверка справедли вости модели двух состояний 46
Ш.2.5.2. Флуоресцентная спектроскопия и применение модели двух состоя ний к анализу денатурации белков мочевиной 52
ІП.2.5.3. Более сложные модели равновесных переходов 54
IV. Резульаты и обсуждение 57
IV. 1. Структурно-термодинамические исследования белков семейства «Бер-
жерак» 57
IV. 1.1. Кристаллизация белков и исследование их структуры методом РСА.57
IV. 1.2. Структуры SHH-SH3 и SHA-SH3, определенные методом ЯМР 64
IV. 1.3. Микрокалориметрические исследования белков «Бержерак» 67
IV. 1.4. Спектры флуоресценции и разворачивание SHA-SH3 мочевиной 74
IV.1.5. Отклонения от одностадийной модели разворачивания 75
IV. 1.6. Обсуждение результатов исследований белков «Бержерак» 76
IV.2. Структурно-термодинамические исследования доменов с пришитыми лиганадами 83
IV.2.1. Дизайн химерных белков с пришитыми лигандами 83
IV.2.1.1. Дизайн F2-SH3 84
IV.2.1.2. Дизайн химерных белков с длинным линкром на основе PWT-SH3.85
IV.2.2. Клонирование белков с пришитыми лигандами 87
IV.2.3. Кристаллизация белков с пришимыми лигандами 88
IV.2.4. Структура F2-SH3, определенная методом ЯМР 89
IV.2.5. Кристаллографическая структура С1-SH3 92
IV.2.6. Исследования термодинамики разворачивания структуры химерных белков с пришитыми лигандами 96
IV.2.6.1.Спектры флуоресценции и равновесное разворачивание структуры химерных белков мочевиной 97
IV.2.6.1.1. Разворачивание F2-SH3 мочевиной 99
IV.2.6.1.2. Разворачивание WT-SH3 и С1-SH3 мочевиной 101
IV.2.6.2. Калориметрические исследования белков 103
IV.2.6.2.1. Исследования F2-SH3 103
IV.2.6.2.2. Оценка возможных отклонений от «идеализированной» модели двух состояний для белка F2-SH3 108
IV.2.6.2.3. Оценка теплоемкости и других параметров для F2-SH3, исходя из структуры белка 115
IV.2.6.2.4. Калориметрические исследования химерных белков с длинными линкерами 119
IV.2.7. Обсуждение результатов структурно-термодлинамических исследований химерных белков с пришитыми лигандами 120
V. Выводы 125
Благодарности 127
Список цитируемой литературы
