Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1 Циркуляция дезоксирибонуклеиновых кислот в крови 8
1.1.1 Источники внеклеточных ДНК крови 8
1.1.2 Состав циркулирующих в крови комплексов внеклеточных ДНК 13
1.1.3 Факторы, влияющие на циркуляцию ДНК в крови 19
1.2 Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты мочи 23
1.2.1 Механизмы появления внеклеточных ДНК в моче 23
1.2.2 ДНК-гидролизующие ферменты мочи 26
1.3 Применение внеклеточных/циркулирующих ДНК в диагностике 28
1.3.1 ДНК-маркеры опухолевых клеток в состве внеклеточных ДНК крови 28
1.3.2 ДНК-маркеры опухолевых клеток в составе внеклеточных ДНК мочи 32
1.3.3 Методы исследования статуса метилирования ДНК 33
1.3.3.1. Выявление метилированных цитозинов без использования метилчувствительных нуклеаз рестрикции 34
1.3.3.2. Выявление метилированных цитозинов в составе ДНК при помощи метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции 39
1.3.3.3. Методы маштабного исследования метилирования геномов 42
1.3.4 Использование циркулирующих/внеклеточных ДНК в диагностике рака предстательной
железы 48
1.3.4.1. Эпидемиология онкологических заболеваний предстательной железы 48
1.3.4.2. Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы 49
1.4 Заключение 55
Глава 2. Материалы и методы 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Реактивы 57
2.1.2. Оборудование 58
2.1.3. ПЦР системы, использованные в работе 59
2.1.4. Клетки, используемые в работе 61
2.1.5. Лабораторные животные 61
2.1.6. Клинические характеристики здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 61
2.2. Методы 64
2.2.1. Подготовка образцов крови и мочи 64
2.2.1.1. Взятие образцов крови 64
2.2.1.2. Приготовление плазмы крови и элюатов с поверхности форменных элементов крови 65
2.2.1.3. Подготовка образцов мочи 65
2.2.2. Определение нуклеазной активности в плазме крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 66
2.2.2.1. Приготовление модифицированного субстрата 66
2.2.2.2. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена 67
2.2.2.3. Определение ДНКазной активности иммуноферментным анализом 67
2.2.3. Выделение ДНК из образцов крови и мочи 68
2.2.3.1.Оптимизация методов выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови и мочи 68
2.2.3.2. Выделение ДНК из образцов крови 69
2.2.3.3. Выделение ДНК из супернатанта мочи 69
2.2.4. Культивирование клеток линии HeLa. 69
2.2.5. Получение лейкоцитов человека 70
2.2.6. Выделение РНК из мембранно-цитозольной фракции клеток линии HeLa 70
2.2.7. Выделение геномной ДНК из клеток линии HeLa и лейкоцитов человека 71
2.2.8. Приготовление стандарта фрагментированной геномной ДНК для последующего определения концентрации внДНК в моче 71
2.2.9. Определение концентраций цир/внДНК в крови и моче 71
2.2.10. Определение концентрации простатического специфического антигена в плазме крови 72
2.2.11. Исследование размера и состава внНК в моче здоровых мужчин и больных с онкологическими заболеваниями предстательной железы 72
2.2.12. Исследование циркуляции и стабильности препаратов очищенной ДНК и ДНК плазмы крови человека in vivo 73
2.2.12.1. Метилирование геномной ДНК 73
2.2.12.2. Приготовление ПЦР-продуктов промоторной области гена GSTP1 73
2.2.12.3. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени 73
2.2.12.4. Оценка стабильности ДНК в сыворотке крови мыши 74
2.2.12.5. Эксперименты, выполненные на лабораторных мышах BALB/с 74
2.2.12.6. Обработка крови мыши и выделение свободной цирДНК 75
2.2.13. Секвенирование цир/внДНК методом Сэнгера 75
2.2.13.1. Приготовление [32P] меченых олигонуклеотидов 75
2.2.13.2. Бисульфитная модификация ДНК 76
2.2.13.3. Получение ДНК промоторной области гена GSTP1 (1001-1302, X08058) при помощи полимеразной цепной реакции 76
2.2.13.4. Секвенирование методом Сэнгера 77
2.2.14. Пиросеквенирование геномной ДНК и свободной цирДНК плазмы крови здоровых доноров и больных раком предстательной железы 77
2.2.14.1. Подготовка образцов ДНК 77
2.2.14.2. Модификация ДНК 78
2.2.14.3. Количественная оценка ДНК до и после модификации 78
2.2.14.4. Пиросеквенирование геномной и циркулирующей ДНК 78
2.2.15. Исследование различий в паттернах метилирования внеклеточной ДНК плазмы крови
здоровых доноров и больных аденокарциномой предстательной железы при помощи микрочипов 79
2.2.15.1. Оптимизация методов эффективного концентрирования цирДНК 79
2.2.15.2. Подготовка образцов цирДНК крови для сравнительного исследования при помощи CpG island microarray 80
2.2.15.3. Проведение микрочипового исследования CpG island microarray 80
2.2.16. Статистическая обработка данных 82
Глава 3. Результаты и обсуждение 83
3.1 Разработка методических подходов к исследованию цирДНК крови и внДНК мочи. 83
3.1.1. Измерение дезоксирибонуклеазной активности. 83
3.1.2. Подготовка образцов цир/внДНК 85
3.1.3. Бисульфитная конверсия внеклеточных ДНК. 92
3.2. Цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 95
3.2.1. Определение уровня общего простатического специфического антигена (ПСА) в крови здоровых доноров и онкологических больных 95
3.2.2. Определение концентраций цир/внДНК при помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и PicoGreen 96
3.2.2.1. Определение концентраций цирДНК в плазме крови 96
3.2.2.2. Определение концентраций цирДНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови 101
3.2.2.3. Определение концентрации внДНК мочи 111
3.2.2.4. Исследование размера фрагментов внНК мочи. 115
3.2.3. Исследование нуклеазной активности при помощи иммуноферментного анализа 118
3.2.3.1. Исследование нуклеазной активности плазмы крови здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 118
3.2.3.2. Исследование нуклеазной активности мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 122
3.2.4. Исследование циркуляции и стабильности свободной ДНК и ДНК в составе биополимеров в
крови 124
3.2.4.1. Исследование стабильности свободной ДНК и ДНК плазмы крови человека в крови мыши в экспериментах in vitro 125
3.2.4.2. Исследование циркуляции метилированной и неметилированной свободной ДНК и ДНК в составе природных комплексов in vivo 128
3.2.5. Исследование различий в паттернах метилирования цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы 131
3.2.6. Исследование цирДНК крови при помощи микрочипового анализа CpG island microarray 135
Заключение 140
Выводы 141
Список сокращений 143
Список литературы
