Введение
I. Обзор литературы
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1. Современные представления о классификации карбогидраз 8
1.2. Структура и функции ксилоглкжана клеточных стенок растений 11
1.3. Ферменты гидролизующие ксилоглюкан .. 16
1.4. Структура и функции нецеллюлозных р-глюканов 23
1.5. Ферменты гидролизуюгцие р-глюканы 26
1.6. Ферменты Aspergillus 30
II. Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты исследования и методика эксперимента 35
2.1. Использованные вещества 35
2.2. Хроматографическое фракционирование и очистка ферментов 36
2.2.1. Разделение препарата AJaponicus 37
2.2.2. Хроматографический анализ препаратов AJaponicus 38
2.2.3. Разделение препарата T.reesei 39
2.3. Определение ферментативной активности и белка ... 42
2.4. Определение биохимических характеристик ферментов 43
2.5. Определение рН-зависимости активности ферментов 43
2.6. Изучение термостабильности ферментов 44
2.7. Определение кинетических параметров действия ферментов 44
2.8. Проведение гидролиза Р-глюкавд, ксилоглкжана и арабиноксилава под действием ферментов 44
2.9. Исследование изменения молекулярно-массового распределения полисахаридов... 44
2.10. Исследование состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полисахаридов 44
2.11. Определение вискозиметрической активности по р-глюкану и карбоксиметилцеллюлозе с одновременным определением выхода ВС 45
2.12. Масс спектрометрический анализ пептидного фингерпринта выделенных белков 45
Обсуждение результатов.
Глава 3. Выделение и очистка ферментов AJaponicus 47
3.1. фракционирование исходного препарата AJaponicus с помощью ионообменной хроматографии на Source 15Q 47
3.2. Очистка р-глюканазы 28 кДа и ксиланазы 35 кДа 60
3.3. Очистка ксиланазы 22 кДа с помощью гидрофобной хроматографии на Phenyl-Superose 62
3.4. Очистка ксилоглюканазы 32 кДа с помощью ионообменной хроматографии на MonoQ 64
3.5. Очисткаарабиноксилан-арабинофурангидролазы 33 кДа 65
Глава 4. Идентификация выделенных ферментов с помощью протеолиза трипсином с последующей масс-спектрометрией пептидов 70
Глава 5. Изучение свойств выделенных ферментов A.japonicus 81
5.1. Активность и кинетические параметры действия ферментов на различные субстраты .. 81
5.2. рН-зависимости и термостабильность ферментов 89
5.3. Механизм гидролиза р-глкжана под действием р-глюканаз, эндоглюканаз и экзо-р-глюкозидазы 96
5.3.1. Изучение продуктов гидролиза с помощью ГПХ 96
5.3.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана 102
5.3.3. Сравнение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана BG 28 A.japonicus и лихеназойДвмбй/ш 105
5.3.4. Изучение начальной стадии гидролиза р-глюкана с помощью вискозиметрии 112
5.4. Механизм гидролиза ксилоглюкана под действием ксилоглюкаиаз и эндоглюканаз 116
5.4.1. Изучение продуктов гидролиза ксилоглюкана с помощью ГПХ... 116
5.4.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза ксилоглюкана 122
Глава 6. Анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов A.japonicus 128
6.1.. Характеристики исходных препаратов 128
6.2. Хроматографическое разделение и определение активности фракций 131
6.3, Анализ состава и содержания ферментов в препаратах , 146
6.3.1. Идентификация известных ферментов Ajaponicus 146
6.3.2. Оценка количественного содержания индивидуальных ферментов 151
Выводы 156
Список литературы
