Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Организация генома эукариот 9
1.2. Особенности структуры сателлитн о К ДНК 10
1.3. Организация короткого плеча хромосом мыши 15
1.4. Роль тело мер в репликации эу кар иотических хромосом 17
1.5. Пространственное расположение центромерных и тсломсрных районов хромосом в интерфазных ядрах 18
1.6. Гетерохроматип и эффект положения 21
1.7. Эпигенетические механизмы формирования гетерохроматина 26
2. Материалы и методы 31
2.1. Плазми ды 31
2.2. Выделение плазм ид ной ДНК, электрофорез ДНК 31
2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 31
2.4. Культивирование клеток 31
2.5. Получение препаратов метафазных хромосом 32
2.6. Клеточная синхронизация, проточная цитофлюорометрия 32
2.7. Получение митотических хромосом из овулировавших ооцитов 32
2.8. Выделение ядер печени мыши 33
2.9. Выделение геномной ДНК мыши 33
2.10. Выявление сайтов репликации 33
2.11. Клонирование фрагментов ДИК фракции хромоцснтров 34
2.12. Секвинирование 34
2.13. Полимсрзиая цепная реакция 34
2.14. Получение меченых фрагментов ДНК 35
2.15. Компьютерный анализ клонированных последовательностей 35
2.16. Определение величины изгиба фрагментов ДНК 35
2.17. Гибридизация на фильтрах 35
2.18. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) 36
2.19. Олигомечение in situ со специфичными праймерами (PRINS) 37
2.20. Флюоресцентная и конфокальня микроскопия 38
2.21. Другие методы исследования 38
3. Результаты 39
3.1. Определение локализации центромерных и теломерных районов хромосом в интерфазных ядрах клеток в культуре 39
3.1.1. Синхронизация клеточной культуры L929 39
3.1.2. Морфология хромоцеитров 39
3.1.3. Локализация минорного, мажорного сателлита и теломер на метафазиых хромосомах клеток культуры L929 41
3.1.4. Распределение минорного, мажорного сателлита в интерфазных ядрах клеток культуры L929 в течение клеточного цикла 41
3.1.5. Локализация теломерной последовательности в интерфазных ядрах клеток культуры L929 в течение клеточного цикла 46
3.1.6. Локализация теломерной последовательности хромосом относительно минорного и мажорного сателлита в G0/G1 и S фазах клеточного цикла 49
3.2. Исследование структуры и локализации последовательностей MS3 и MS4 выделенных из фракции ДНК хром о центров мыши 52
3.2.1. Структура первичной последовательности MS3 и MS4 52
3.2.2. Анализ геномной организации MS3 и MS4 методом гибридизации по Саузерну и полимеразной цепной реакции 56
3.2.3. Оценка содержания MS3 и MS4 в геноме мыши 58
3.2.4. Сравнение степени изогнутости фрагментов сателлитных ДНК и их возможность формировать структуры подобные MAR 58
3.2.5. CENP-B бокс в последовательностях MS3 и MS4 62
3.2.6. Локализация MS3 и MS4 в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах клеток линии L929 63
3.2.7. Локализация фрагментов сателлитиой ДНК в ядрах печени мыши 65
3.2.8. Определение положение последовательностей MS3 и минорного сатгсллита на препаратах преждевременно конденсированных хромосом 67
4. Обсуждение результатов 70
Выводы 89
