Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ 14
2.2. Эпизоотология ЧМЖЖ 15
2.2.1. Распространение ЧМЖЖ 15
2.2.2. Факторы распространения ЧМЖЖ 18
2.3. Биологические свойства вируса ЧМЖЖ 20
2.4. Физико-химические свойства вируса ЧМЖЖ 23
2.5. Антигенные свойства вируса ЧМЖЖ 25
2.6. Диагностика ЧМЖЖ 26
2.7. Молекулярно-генетические методы диагностики 29
2.7.1. Полимеразная цепная реакция 29
2.7.2. Применение ПЦР для диагностики ЧМЖЖ 33
2.8 .Выводы по обзору литературы 34
Собственные исследования 36
3. Материалы и методы 36
3.1. Материалы 36
3.1.1. Вирусы и вируссодержащие материалы 36
3.1.2. Реактивы, растворы и оборудование 36
3 3.2. Культивирование и титрование вируса ЧМЖЖ 39
3.3. Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ 40
3.4. Оценка эффективности методов очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ 41
3.5. Электрофоретический анализ белков ЧМЖЖ 42
3.6. Электрофоретический анализ вирусного белка в ПААГе 42
3.7. Выделение нуклеиновых кислот из очищенных препаратов вирусов, культуральных и органо-тканевых вируссодержащих материалов 42
3.7.1. Выделение РНК из очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ 43
3.8. Сбор данных нуклеотидных последовательностей вируса 44
3.9. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 44
3.10. Конструирование праймеров 44
3.11. Синтез и очистка олигонуклеотидов 44
3.11.1 Синтез кДНК на РНК вируса 45
3.12. Оптимизация параметров постановки ПЦР при идентификации 45
3.12.1. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот 46
3.12.2. Определение чувствительности и специфичности ПНР 46
3.12.3. Определение диагностической ценности ПЦР 47
3.13. Постановка и учет результатов серологических реакций 47
3.13.1. Подготовка проб патологического материала 47
3.13.2. Постановка РДП 47
3.13.3. Постановка ИФА 48
3.14. Статистическая обработка данных 49
4. Результаты исследований 50
4.1. Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ 50
4.1.1. Подбор оптимальных условий культивирования вируса ЧМЖЖ 50
4.1.2. Получение очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов 51
4.1.3. Электронномикроскопическое изучение морфологии и структуры вируса ЧМЖЖ 53
4.2. Подбор оптимальных методов выделения РНК вируса 55
4.3. Определение физико-химических свойств РНК вируса ЧМЖЖ 57
4.3.1. Определение константы седиментации РНК вируса ЧМЖЖ 57
4.3.2. Определение плавучей плотности РНК вируса ЧМЖЖ 57
4.4. Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса чумы МЖЖ в международных базах данных 58
4.5. Разработка метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ 62
4.5.1. Подбор праймеров 62
4.5.2. Подбор и отработка температурно-временного режима 65
4.5.3. Подбор оптимальных условий проведение ПЦР 70
4.5.4. Определение специфичности и чувствительности ПЦР при идентификации ЧМЖЖ 76
4.5.5. Тест-система для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР 79
4.6. Комиссионная апробация тест-системы для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР 82
4.7. Эпизоото логический мониторинг и использование метода ПЦР для выявления кДНК вируса ЧМЖЖ в полевых материалах 86
5. Обсуждение 100
6. Выводы 106
7. Практические предложения 107
8. Список литературы 108
9. Приложение 125
