Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Два типа вторичной клеточной стенки растительных волокон 13
1.1.1. Вторичная клеточная стенка классического, ксиланового, типа у растительных волокон 15
1.1.2. Вторичная клеточная стенка особого, желатинозного, типа у растительных волокон 20
1.1.2.1. Состав и структура клеточной стенки желатинозного типа... 23
1.1.2.2. Механизмы реализации функциональной нагрузки клеточной стенки желатинозного типа 28
1.2. Постсинтетические модификации полимеров клеточной стенки 34
1.2.1. Ферменты, локализованные в клеточной стенке и модифицирующие ее компоненты 34
1.2.1.1. Гликаназы (гликозидгидролазы) 36
1.3. Подходы к анализу ферментов клеточной стенки растительных волокон 37
1.4. Формирование желатинозной клеточной стенки флоэмных волокон льна 42
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 51
2.1. Объекты исследований 51
2.2. Оценка галактаназной активности 54
2.2.1. Анализ низкомолекулярных углеводов 54
2.2.2. Измерение р-галактозидазной активности с помощью хромогенного субстрата 54
2.2.3. Окрашивание срезов с помощью флуорогенного субстрата 55
2.3. Выделение и идентификация (3-галактозидазы 55
2.3.1. Выделение тканеспецифичного галактана и ассоциированного с ним белка 55
2.3.2. Постановка одномерного электрофореза по Лэммли 56
2.3.3. Идентификация белка методом ВЭЖХ МС 56
2.3.4. Анализ аминокислотной последовательности белка с помощью методов биоинформатики 58
2.4. Получение поликлональных антител 58
2.4.1. Получение антигена 58
2.4.2. Иммунизация препаратом белка 59
2.4.3. Подтверждение специфичности полученных антител 60
2.5. Анализ срезов растений методами микроскопии и иммуноцитохимии 61
2.6. Определение содержания мРНК методом ПЦР в реальном времени.. 63
2.7. Выделение полимеров, слабо связанных с микрофибриллами целлюлозы клеточной стенки 65
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 67
3.1. Галактаназная активность в тканях стебля льна 67
3.1.1. Определение содержания низкомолекулярных углеводов в тканях стебля льна на разных стадиях развития волокон 67
3.1.2. Оценка Р-галактозидазной активности в тканях стебля льна с помощью искусственных субстратов 71
3.2. Выявление и идентификация фермента, осуществляющего модификации тканеспецифичного галактана волокон льна 74
3.2.1. Анализ Р-галактозидазной активности во фракции, содержащей тканеспецифичный галактан 74
3.2.2. Белковый состав фракции, содержащей тканеспецифичный галактан 77
3.2.3. Анализ выявленного во фракции высокомолекулярного галактана белка методами протеомики и биоинформатики 79
3.3. Субклеточная локализация Р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений, волокна которых формируют клеточную стенку желатинозного типа 90
3.3.1. Получение поликлональных антител к исследуемому белку и оценка степени их специфичности 90
3.3.2. Иммуноцитохимическая локализация р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений 93
3.4. Особенности формирования клеточной стенки желатинозного типа у трансгенных растений льна с антисмысловои конструкцией к гену тканеспецифичной р-галактозидазы волокон 96
3.4.1. Общая характеристика трансгенных растений льна 96
3.4.2. Анализ Р-галактозидазной активности в трансгенных растениях льна 100
3.4.3. Особенности структуры клеточной стенки волокон льна с пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы 102
3.4.4. Локализация галактана в клеточной стенке волокон льна с нормальной и пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы 105
3.4.5. Содержания тканеспецифичного галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, в клеточной стенке трансгенных растений льна 108
Заключение 111
Выводы 116
Список литературы 118
