Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Осина (Populus tremula L.) как объект исследований 10
1.2. Клональное микроразмножение 12
1.2.1. Этапы и факторы клонального микроразмножения 14
1.2.2. Индукция развития пазушных меристем 15
1.2.3. Растения рода Populus как объект для получения культуры тканей 16
1.3. Создание трансгенных растений 17
1.3.1. Методы переноса генетического материала 17
1.3.1.1. Трансформация растений на основе агробактериального вектора 18
1.3.1.2. Трансформация inplanta.. 21
1.3.2. Трансформации растений рода Populus 24
1.4. Конъютирование ИУК 29
1.4.1. Гликозильные конъюгаты ИУК 31
1.4.1.1 УДФГ-трансфераза из кукурузы и ген ugt {iaglu), кодирующий этот фер мент 33
1.4.1.2. Трансформация растений геном ugt 35
1.5. Гомеостаз ИУК 39
1.5.1. Особенности инактивации ауксина в культуре клеток и тканей растений 40
1.5.2. Гомеостаз ИУК на разных стадиях онтогенеза 41
1.6. Растения с измененным ауксинсвым гомеостазом 45
1.6.1. Мутантные растения арабидопсиса 45
1.6.2. Трансформация растений генами бактериального пути биосинтеза ИУК 46
1.7. Белки, связывающие ацил-Кофермент А 49
1.7.1. Растительные белки, связывающие ацил-КоА 51
2. Цель и задачи исследований 58
3. Объекты и методы исследований 59
3.1. Объекты исследований 59
3.1.1. Растительный материал 59
3.1.1.1. Стерилизация исходных эксплантов 59
3.1.1.2. Условия клонального микроразмножения растений 60
3.1.1.3. Условия выращивания растений на фитотроне и в открытом грунте...61
3.1.2. Бактериальные штаммы .61
3.1.2.1. Условия культивирования бактериальных штаммов 64
3.1.2.2. Трехродительское скрещивание 64
3.2. Трансформация растений 64
3.2.1. Условные обозначения трансформированных растений 65
3.3. Селекция трансформированных растений .65
3.4. Выделение плазмидной ДНК 66
3.5. Выделение растительной ДНК 66
3.6. Выделение тотальной РНК из растений 67
3.7. Полимеразная цепная реакция 68
3.8. Саузерн блот гибридизация 69
3.8.1. Приготовление ДНК-блотов по Саузерну 69
3.8.2. Приготовление меченого зонда. 70
3.8.3. Гибридизация по Саузерну 71
3.9. Гибридизация РІЖ .73
3.10.Определение активности Р-глюкуронидазы 73
3.11. Количественное определение содержания ИУК 74
3.12. Определение активности УДФГ-трансферазы 75
3.13. Статистическая обработка данных ...75
3.14. Использованные реактивы 76
4. Результаты исследований 77
4.1. Получение трансконъюгантов и их анализ .77
4.2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности маркерных ферментов 79
4.2.1. Введение в культуру in vitro растений осины 79
4.2.1.1. Индукция корнеобразования у растений осины 79
4.2.1.2. Влияние ИМК на корнеобразование осины 80
4.2.1.3. Индукция развития пазушных меристем 81
4.2.2. Устойчивость трансформированных растений к селективному антибиотику 83
4.2.3. Изучение активности маркерного фермента Р-глюкуронидазы в трансгенных растениях осины 86
4.3. Молекулярно-биологические доказательства трансформации 88
4.3.1. Доказательства интеграции гена acb в геном растений осины 88
4.3.2. Доказательства интеграции и экспрессии гена ugt в трансгенных растениях осины 94
4.4. Биохимические подтверждения состоявшейся трансформации 101
4.4.1. Активность УДФГ-трансферазы в трансгенных растениях осины 101
4.4.2. Изучение влияния трансформации на содержание свободной ИУК в трансгенных растениях ...103
4.4.3. Влияние ИУК на рост трансгенных растений осины, 104
4.5. Оценка физиологических параметров трансгенных растений 108
4.5.1. Рост трансгенных растений осины in vitro 108
4.5.2. Трансгенные растения в условиях фитотрона 113
4.5.3. Рост трансгенных растений осины на полевой делянке 116
4.5.4. Фенологические наблюдения за трансгенными растениями, произрастающими на полевой делянке 118
5. Обсуждение 122
Заключение 37
Выводы 139
Литература 141
