Введение
I. Обзор литературы. Механизмы котранскрипционного сопряжения процессинга РНК .
1. Введение. «Гипотеза сопряжения». 8
2. С-концевой домен большой субъединицы РНК-полимеразы II. 13
3. КодСТО. 15
3.1. Гипотеза CTD-кода. 16
3.2. Фосфорилирование остатков серина в CTD. 18
3.3. Фосфорилирование тирозина-1 и треонина-4. 23
3.4. Динамическое фосфорилирование аминокислотных остатков CTD в транскрипционном цикле 26
3.5. Изомеризация пролинов в CTD. 27
4. Заключение. Перспективы развития. 31
II. Материалы и методы.
1. Химические реактивы. 33
2. Вода. 34
3. Нуклеиновые препараты. 34
4. Препараты белков (ферментов). 35
5. Бактериальные штаммы, компетентные клетки. Работа с бактериальными культурами и индивидуальными клонами . 36
6. Радионуклидные препараты. Введение метки в ДНК и РНК. 37
7. ДНК. 37
8. Секвенирование. 38
9. РНК. 38
10. Картирование сайтов старта транскрипции. 39
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 39
12. Ядерный матрикс. Связывание фрагментов ДНК с ядерным матриксом in vitro, 40
13. Культивируемые клеточные линии человека. Трансфекция. 41
14.Определение промоторной активности по уровню экспрессии люцнферазы и «маркерного» фермента в лизатах
трансфицированных эукариотических клеток. 42
15. Компьютерные программы и электронные ресурсы. 43
III. Результаты и их обсуждение.
1. Структура гена hGHR. Функциональная карта кодирующей области и проксимальной 5-НТО. Картирование основных элементов гена hGHR. 45
2. Анализ in silico локуса гена hGHR.
2.1. Общая характеристика и регуляторные области . 51
2.2. Характеристика структуры хроматина. 53
3. Характеристика нетранслируемых областей гена hGHR,
3.1. Характеристика 5-НТО. Картирование 5-нетранслируемых экзонов гена hGHR. 54
3.2. Картирование сайтов старта транскрипции в 5-НТО. 57
3.3. Характеристика З-НТО гена hGHR. 58
3.4. Изучение взаимодействия участков нетранслируемых областей с ядерным матриксом in vitro. 59
4. Картирование и изучение активности in vitro основных промоторов гена GHR человека .
4.1. Промотор Р1, специфический для взрослой печени. 61
4.2. Общетканевой промотор Р2.
4.2.1. Характеристика промоторной области. 63
4.2.2. Изучение влияния короткой открытой рамки считывания (кОРС), расположенной в 5-нетранслируемом экзонс V2 гена GHR, на экспрессию репортерного гена люциферазы . 64
4.3. Другие промоторы генов GHR.
4.3.1. Картирование предполагаемого промотора РЗ. 66
4.3.2. Изучение предполагаемых промоторных районов
экзонов V5 и V9. 67
5. Нетранслируемый «экзон»
5.1. Картирование V6 в хромосоме 11 человека. 70
5.2. Клонирование хромосомного фрагмента гена hMOGAT2. 70
5.3. Анализ экспрессии V6 в тканевых и клеточных РНК. 71
5.4. Анализ экспрессии гена hMOGAT2 в некоторых тканях человека и клеточных линиях. 71
5.5. Идентификация антисмыслового транскрипта в локусе гена hMOGAT2. 73
5.6. Картирование промотора в 5-области V6. 78
5.7. Гипотетііческий механизм образования химерного транскрипта V6 в результате глраис-сипайсиига. 79
6. Изучение экспрессии гена hGHR в некоторых человеческих тканях, культивируемых клеточных линиях и образцах опухолей . 82
6.1. 5-иетранлсируемая область гена hGHR.
6,1 Л. Идентификация новых 5- нетранслируемых экзонов гена hGHR. 84
6.1.2. Экспрессия 5-нетранслируемых экзонов гена hGHR в клеточных линиях. 85
6.2. Транслируемая область гена hGHR.
6.2.1. Экспрессия мРНК hGHR в некоторых тканях и клеточных линиях. 86
6.2.2. Исследование экспрессии мРНК гена hGHR в некоторых клеточных линиях. 86
6.2.3. Анализ экспрессии форм мРНК hGHR в образцах опухолей и в клеточных линиях опухолевого происхождения. 87
6.2.4. Гипотетический механизм образования и возможная роль укороченной формы мРНК гена hGHR. 88
6.3. Изучение влияния суперэкспрессии компонентов хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF на экспрессию и альтернативный сплайсинг мРНК hGHR. 95
7. Полиморфизм и мутации в гене hGHR.
7.1. Полиморфизм области экзона 3 гена hGHR. 97
7.2. Сравнительный анализ полиморфизма экзона 3 гена hGHR
в группе пациентов с идиопатической низкорослостью (ИН).
7.3. Синдром Ларона.
Заключение.
Выводы.
Список литературы.
