СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................... 6
ВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................... 19
1.1. Традиционные прямые и непрямые методы исследования
трансмембранного транспорта в интактных органеллах и клетках............... 19
1.2. Митохондрии печени крысы и дрожжи Saccharomyces cerevisiae –
удобные модельные объекты исследований .................................................... 24
1.3. Транспортеры митохондрий млекопитающих и митохондрий
S. cerevisiae........................................................................................................... 33
1.4. Сопрягающая мембрана митохондрий печени крысы и плазмалемма
S. cerevisiae, протонные помпы, протонофорный цикл .................................. 40
1.5. Структура и механизм мембранотропного действия пороформеров
аламетицина, мелиттина и мастопарана ........................................................... 44
1.6. Медицинское значение пороформеров аламетицина, мелиттина и
мастопарана.......................................................................................................... 65
1.7. Молекулярные характеристики транспортеров С4-дикарбоксилатов и
механизм транслокации...................................................................................... 69
1.7.1. Транспортеры дикарбоксилатов. Общие сведения, роль
в метаболизме ...................................................................................................... 69
1.7.2. Первичная структура транспортеров дикарбоксилатов........................ 73
1.7.3. Вторичная структура транспортеров дикарбоксилатов........................ 75
1.7.4. Механизм транспорта и специфичность переносчиков........................ 80
1.7.5. Реконструкция трехмерной структуры активного центра и механизм
транслокации ... ..........………………………………………………………….84
1.7.6. Предполагаемая третичная структура транспортеров
дикарбоксилатов.................................................................................................. 91
1.8. Трехмерные структуры трансмембранных транспортеров ..................... 923
1.9. Теоретическое обоснование некоторых используемых в работе
методических приемов ....................................................................................... 97
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 104
2.1. Реагенты...................................................................................................... 104
2.2. Модельные организмы............................................................................... 105
2.3. Условия выращивания и предобработки клеток S. cerevisiae ............... 105
2.4. Выделение митохондрий дрожжей S. cerevisiae..................................... 107
2.5. Выделение митохондрий печени крысы. Получение
субмитохондриальных частиц (СМЧ) и митохондрий с поврежденной
мембраной.......................................................................................................... 108
2.5.1. Выделение митохондрий печени крысы............................................... 108
2.5.2. Получение митопластов и субмитохондриальных частиц (СМЧ) из
митохондрий печени крысы ............................................................................ 109
2.5.3. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы СМЧ........................ 110
2.5.4. Получение митохондрий с поврежденной внешней мембраной ....... 111
2.6. Выделение мастопарана и мелиттина ...................................................... 111
2.7. Определение количества белка митохондрий......................................... 112
2.8. Определение количества глюкозы ........................................................... 112
2.9. Измерение скорости поглощения кислорода клетками S. cerevisiae,
митохондриями печени крысы и митохондриями дрожжей ........................ 112
2.10. Регистрация потенциала, генерируемого на внутренней мембране
митохондрий ...................................................................................................... 113
2.11. Измерение набухания митохондрий и определение концентрации
амфифила, вызывающей лизис митохондрий ................................................ 114
2.12. Определение доли доступной мембранной фазы клеток..................... 115
2.13. Синтез производных малата и малоната ............................................... 116
2.14. Определение коэффициентов распределения O-ацил-L-малатов в
системе октанол/среда ...................................................................................... 117
2.15. Определение размеров молекул ............................................................. 117
2.16. Расчет действующей концентрации амфифильных пептидов ............ 1184
2.17. Определение кинетических параметров ................................................ 118
2.18. Молекулярно-генетические методы....................................................... 119
2.19. Представление результатов..................................................................... 122
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................ 124
3.1. Митохондрии печени крысы – биосенсоры трансмембранного тока... 124
3.1.1. Оценка гомогенности и стабильности митопластов, образующихся из
митохондрий печени крысы при действии индукторов проницаемости .... 124
3.1.2. Особенности активации v4 митохондрий печени крысы в
монокалиевой среде валиномицином и мелиттином .................................... 125
3.2. Непрямые методы измерения трансмембранного транспорта в
митохондриях печени крысы и в клетках S. cerevisiae ................................. 131
3.2.1. Сукцинатоксидазная система препарата митохондрий печени крысы в
присутствии протонофора – эндогенная сопряженная система для измерения
транспорта интактным дикарбоксилатным транспортером (ДКТ).............. 131
3.2.2. Эндогенная сопряженная система клеток для изучения транспорта
сукцината и пирувата через плазмалемму S. cerevisiae ................................ 133
3.2.2.1. Подбор условий для измерения низкой скорости окисления
сукцината клетками S. cerevisiae .................................................................... 134
3.2.2.2. Эквивалентность прямого и непрямого методов измерения
транспорта пирувата в клетки S. cerevisiae .................................................... 136
3.2.2.3. Измерение транспорта сукцината в клетки S. cerevisiae.................. 139
3.2.2.4. Непроницаемость плазматической мембраны S. cerevisiae для
ингибиторов транспорта................................................................................... 145
3.3. Характеристики пороформеров мелиттина, аламетицина и мастопарана
и тетраацетилмелиттина в сопрягающей мембране интактных митохондрий
печени крысы..................................................................................................... 150
3.3.1. Природа стадии, лимитирующей активацию v4 митохондрий печени
крысы мелиттином, мастопараном и тетраацетилмелиттином (ТАМ) ....... 150
3.3.2. Природа двуфазной зависимости от времени активации v4
митохондрий печени крысы аламетицином................................................... 1555
3.3.3. Природа стадии, лимитирующей первую фазу активации v4
митохондрий печени крысы аламетицином................................................... 158
3.4. Энзимологическая характеристика нового транспортера
дикарбоксилатов плазмалеммы S. cerevisiae ................................................. 161
3.4.1. рН профиль транспортера дикарбоксилатов плазмалеммы
S. cerevisiae......................................................................................................... 174
3.4.2. Регуляция транспортера дикарбоксилатов плазмалеммы S. cerevisiae
катионами........................................................................................................... 177
3.5. Моделирование конформации 2-алкилмалонатов
и O-ацил-L-малатов с минимальной потенциальной энергией ................... 182
3.6. Использование амфифильных производных субстратов для изучения
активного центра транспортера дикарбоксилатов плазмалеммы
дрожжей S. cerevisiae ....................................................................................... 185
3.7. Методические принципы и подходы, использованные в работе .......... 189
3.8. Методические достижения и анализ новых свойств пороформеров.... 190
3.9. Уникальные свойства транспортера дикарбоксилатов
плазматической мембраны S. cerevisiae.......................................................... 197
3.10. Липофильный профиль канала переносчика дикарбоксилатов
плазмалеммы S. cerevisiae, сравнение с липофильным профилем
канала ДКТ митохондрий печени крысы ...................................................... 201
3.11. Перспективы изучения липофильных профилей ионных каналов с
точечными мутациями...................................................................................... 206
3.12. Преимущества использования эндогенных сопряженных систем по
сравнению с традиционными прямыми методами измерения
трансмембранного транспорта......................................................................... 210
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................ 213
ВЫВОДЫ........................................................................................................... 215
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................. 217
