Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Строение семенника и сперматогенез хряка in vivo 12
1.2 Способы выделения сперматогоний и их очистка
1.2.1 Флуоресцентно-активированная клеточная селекция, FACS 18
1.2.2 Магнитно-активированная клеточная селекция, MACS 19
1.2.3 Разделение клеток в различных градиентах плотности 20
1.2.4 Разделение клеток при помощи метода, основанного на различных адгезивных способностях клеток 23
1.3 Двухмерное культивирование ранних мужских половых клеток млекопитающих in vitro 26
1.3.1 Роль микроокружения в пролиферации и дифференцировке сперматогоний in vitro. Клетки Сертоли 26
1.3.2 Роль факторов роста в пролиферации и дифференцировке сперматогоний in vitro 30
1.3.3 Роль внеклеточного матрикса в пролиферации и дифференцировке сперматогоний in vitro 33
1.4 Трехмерное культивирование ранних мужских половых клеток млекопитающих in vitro 34
1.4.1 Трехмерное культивирование в гелях, представленных коллагеном, метилцеллюлозой, альгинатом кальция и мягким агаром . 35
1.4.2 Трехмерное культивирование в твердых порообразных матрицах 40
1.5 Заключение 43
2 Собственные исследования 45
2.1 Материалы исследований 45
2.1.1 Подготовка животных 45
2.1.2 Приборы и оборудование 48
2.1.3 Культуральные среды, растворы и реактивы
2.1.3.1 Ростовые среды 49
2.1.3.2 Специальные среды и растворы 49
2.1.4 Культуральная посуда 51
2.2 Методы исследований 52
2.2.1 Подготовка фидерного слоя 52
2.2.1.1 Выделение клеток Сертоли 52
2.2.1.2 Митотическая инактивация фидерного слоя 52
2.2.2 Выделение и очистка сперматогоний хряка 53
2.2.1.1 Механический метод выделения 53
2.2.1.2 Ферментативный метод выделения 53
2.2.1.3 Очистка сперматогоний хряка
2.2.3 Двухмерное культивирование сперматогоний хряка 56
2.2.4 Трехмерное культивирование сперматогоний хряка
2.2.4.1 Трехмерные матрицы для культивирования 56
2.2.4.2 Культивирование сперматогоний хряка в гелях 57
2.2.4.3 Культивирование сперматогоний хряка в твердых порообразных матрицах 59
2.2.5 Идентификация клеток хряка in vitro 59
2.2.5.1 Идентификация сперматогоний в культуре 59
2.2.5.2 Идентификация клеток Сертоли в культуре
2.2.6 Сравнительный анализ экспрессии генов 61
2.2.7 Анализ клеток в трехмерной системе 62
2.2.8 Определение доли жизнеспособных клеток 63
2.2.9 Криоконсервирование и хранение клеток 64
2.3 Результаты исследований 65
2.3.1 Выделение сперматогоний из семенников хряков: влияние метода разделения клеток на степень очистки сперматогоний от других типов клеток 65
2.3.2 Влияние клеток Сертоли на сперматогонии хряка в культуре 69
2.3.3 Трехмерное культивирование сперматогоний хряка
2.3.3.1 Оценка влияния материала матрикса и концентрации клеток на жизнеспособность сперматогоний хряка 76
2.3.3.2 Культивирования сперматогоний хряка в метилцеллюлозе
3 Обсуждение 91
4 Заключение
4.1 Выводы 100
4.2 Практические предложения
Список литературы
