Введение
Обзор литературы 18
1.1. Диагностика инфаркта миокарда . 18
1.1.1. Миоглобин 24
1.1.2. Белок, связывающий жирные кислоты 24
1.1.3. Лактатдегидрогеназа 25 1.1.4 Креатинкиназа 26
1.1.5. Тропонин Т 26
1.1.6. Тропонин I 27
1.2. Тропонин I. Биохимия и применение в медицине 28
1.2.1. Тропониновый комплекс 28
1.2.2 Тропонин Т 29
1.2.3. Тропонин С 31
1.2 4. Тропонин I 34
1.2.5. Регуляция мышечного сокращения 35
1.2.6. Взаимодействие тропонина I с тропонином Т. 40
1.2.7. Фосфорилирование Tnl. 42
1.2.8. Ингибиторные участки Tnl и его взаимодействие с актином и тропомиозином . 46
1.2.9. Тропонин І в диагностике ИМ. 48
1.3. Белок, связывающий жирные кислоты 60
1.3.1. Общая характеристика 60
1.3.2. FABP как маркер инфаркта миокарда 67
ГЛАВА 2. 73
Материалы и методы 73
2.1. Получение моноклональных антител С5. 73
2.2. Определение классов и субклассов моноклональных антител. 74
2.3. Аффинная очистка моноклональных антител на РгА-Sepharose . 75
2.4. Определение концентрации моноклональных антител. 75
2.5. Образцы ткани. 75
2.6. Тестирование тканей. 76
2.7. Приготовление аффинной колонки для выделения тропонинового комплекса. 76
2.8. Определение концентрации cTnl, cTnT. 77
2.9. Получение конъюгата моноклональных антител с биотином. 77
2.10. Получение конъюгата моноклональных антител с хелатом европия 77
2.11. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле. 78
2.12. Окраска геля. 78
2.13. Иммуноблоттинг. 79
2.14. Приготовление растворов тропонина I. 79
2.15. Твердофазный иммуноферментный анализ. 80
2.16. Идентификация белков тропонинового комплекса. 81
2.17. Образцы сывороток от больных с инфарктом миокарда, нестабильной стенокардией и от здоровых доноров. 81
2.18. Выделение FABP. 82
2.19. Выделение тропонинового комплекса. 83
2.20. Приготовление аффинной колонки для получения
сыворотки, не содержащей cTnl. 84
2.21. Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной основе 84
2.22. Взаимодействие моноклональных антител с
синтетическими пептидами. 86
2.23. Моделирование некроза сердечной ткани. 87
2.24. Иммобилизация человеческого сердечного ТпС на BrCN-активированной сефарозе. 87
2.25. Исследование взаимодействия Tnl с иммобилизованным ТпС. 88
2.26. Фосфорилирование cTnl цАМФ-зависимой протеинкиназои. 89
2.27. Определение участков взаимодействия cTnl с ТпС. 90
ГЛАВА 3 91
Результаты и их обсуждение 91
3.1 Разработка нового метода выделения cTnl из сердца человека. 91
3.2 Получение моноклональных антител к cTnl. 103
3.3 Попытка разработки диагностической системы для количественного определения cTnl в крови больных с ИМ . 107
3.4 Влияние образования бинарного комплекса TnC - cTnl на взаимодействие антител с антигеном. 112
3.5 Изучение кинетики выведения очищенного cTnl и cTnl в форме комплекса с другими тропонинами из кровотока экспериментальных животных 122
3.4. Использование метода смешанного сэндвича для количественного определения бинарного комплекса cTnl - TnC
в крови больных. 125
3.5. Комплекс cTnl - сТпТ в крови больных инфарктом миокарда. 129
3.6. Получение нового поколения моноклональных антител к тропонину I, одинаково эффективно узнающих как свободный cTnl, так и cTnl в комплексе с другими тропонинами. 132
3.7. Синтез библиотеки пептидов cTnl и эпитопное картирование моноклональных антител. 134
3.8. Перекрестное взаимодействие МАТ с сердечными изоформами cTnI других видов животных. 151
3.9. Определение участков взаимодействия cTnl с ТпС. 152
3.10. Изучение биохимических факторов, оказывающих влияние на взаимодействие cTnl с антителами 158
3.10.1. Протеолитическая дефадация cTnl в ткани сердечной мышцы при некрозе. 158
3.10.2. Влияние молекулы ТпС на стабильность cTnl 169
3.10.3. Влияние фосфорилирования cTnl цАМФ-
зависимой протеинкиназои in vitro на связывание антител с cTnl. 171
3.10.4. Влияние гепарина на связывание антител с cTnl 177
3.11. Создание новой диагностической системы для количественного определения cTnl 179
3.12. Исследование влияния различных факторов на пару моноклональных антител 19С7 - 8Е10. 181
3.13. Предварительные клинические испытания новой диагностической системы. 185
3.14. Определение верхней границы нормы для cTnl. 186
3.15. Диагностическая система для количественного
определения белка, связывающего жирные кислоты (FABP). 189
3.16. Исследование содержания cTnl и FABP в сыворотках
больных инфарктом миокарда и нестабильной стенокардией. 197
3.17. Использовние полного тропонинового комплекса с качестве стандарта в диапностических системах 201
3.18. Использование тропонинового комплекса для калибровки диагностических систем. 205
Выводы 214
Список цитируемой литературы
