Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1. Общие представления о секреции белков 10
1.1. Транслокационный аппарате, coli 13
1.1.1. SecA - транслокационная АТРазаЕ coli 13
1.1.2. Транслоказа SecYEGDFYajC 15
1.2. Модель Sec-зависимого секреторного пути 19
2. Молекулярные шапероны и их роль в секреции белков.. 22
2.1. Общее представление о шаперонах 22
2.2. Неспецифические шапероны Е. coli 26
2.2.1. Белки DnaK/J, GrpE 26
2.2.2. Белки GroEL/ES 28
2.2.3. SRP 31
2.3. Экспорт-специфический шаперон SecB 33
2.3.1. Кристаллическая структура SecB 33
2.3.2. Взаимодействие SecB с пребелками 36
2.3.3. Взаимодействие шаперона SecB с транслокационной ATPasonSecA 39
2.3.4. Взаимодействие комплекса пребелок-SecB-SecA и белков транслокационного канала 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1.Материалы 44
2.1.1. Бактериальные штаммы 44
2.1.2. Плазмиды 44
2.1.3. Среды и растворы 44
2.1.4. Реактивы 46
2.2.Методы 47
2.2.1.Условия культивирования 47
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК 47
2.2.3. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация48
2.2.4. Определение активности щелочной фосфатазы 49
2.2.5. Анализ спектра изоформ щелочной фосфатазы 49
2.2.6. Субклеточное фракционирование 50
2.2.7. Определение скорости превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo 50
2.2.8. Электрофорез белков 51
2.2.9. Иммуноблотинг 51
2.2.10. Иммунопреципитация 52
2.2.11. Определение концентрации белка 52
3. Результаты исследования 53
Секреция щелочной фосфатазы зависит от присутствия в клетках белка SecB 53
3.1.1. Зависимость секреции щелочной фосфатазы от SecB определяется температурой культивирования 54
3.1.2. Влияние SecB на секрецию зависит от источника углерода для роста клеток 57
3.1.3. Секреция щелочной фосфатазы, но не синтез и посттрансляционная модификация зависит от присутствия SecB 58
Секреция щелочной фосфатазы зависит от активности SecA и эта зависимость определяется наличием в клетке SecB 62
Белки SecB и SecA взаимодействуют с экспорт-инициирующим доменом зрелой части щелочной фосфатазы 65
3.3.1. Влияние SecB и SecA на секрецию щелочной фосфатазы определяется первичной структурой экспорт-инициирующего домена 66
3.3.2. Содержание белков SecB и SecA в клетках Е. coli не зависит от уровня секреции щелочной фосфтазы, определяемого первичной структурой экспорт-инициирующего домена 70
3.3.3. Содержание цитоплазматических факторов секреции в иммунопреципитате предшественника щелочной фосфатазы зависит от первичной структуры его экспорт-инициирующего домена 72
3.4. N-концевая область сигнального пептида не участвует во взаимодействии с белками SecB и SecA, но делит с ними функцию таргетинга преРпоАк мембране 73
3.4.1. Смена заряда N-концевой области сигнального пептида снижает секрецию щелочной фосфатазы в зависимости от содержания в клетках белка SecB 74
3.4.2. Влияние смены заряда N-концевой области сигнального пептида на секрецию щелочной фосфатазы зависит от активности белка SecA 78
3.4.3. Смена заряда N-концевой области сигнального пептида увеличивает зависимость секреции от SecB и SecA, и не влияет на их содержание в иммунопреципитате PhoA 79
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 82
Выводы 90
Литература 91
