Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 10
2.1 .Общие понятия о везикулярном транспорте 10
2.2. Рецептор эпидермального фактора роста 12
2.2.1. Общие сведения о рецепторе ЭФР 12
2.2.2. Сигнальные молекулы, связанные с рецептором ЭФР 14
2.3. Общая схема РОЭ 14
2.4. Регуляция РОЭ 18
2.4.1. Белки, участвующие в интернализации ЭФР-рецепторных комплексов 18
2.4.2. Белки, опосредующие слияние мембран 21
2.4.3. Белки, участвующие в переходе из ранних в поздние эндосомы 23
2.5. Фосфатидилинозитол-киназы 26
2.6. Роль убиквитинирования белков в регуляции РОЭ 30
2.6.1. Убиквитинирование 30
2.6.2. Протеасомы и их ингибиторы 34
2.6.3. Убиквитин-лигаза с-СЫ 35
3. Материалы и методы 45
3.1. Культивирование клеточных линий 45
3.2. Получение йодированного ЭФР 45
3.3. Обработка клеток ингибиторами 46
3.4. Стимуляция эндоцитоза 46
3.5. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17%Перколла 47
3.6. Получение мембранных фракций 48
3.7. Получение тотально-клеточного лизата 48
3.8. Иммунопреципитация 48
3.9. Электрофоретическое разделение белков 49
3.10. Иммуноблотинг 49
3.11. Иммунофлуоресценция 49
3.12. Антитела 50
4. Результаты 52
4.1. Участие протеасом в эндоцитозном процессинге рецептора ЭФР 52
4.2. Влияние ингибитора протеасом MG132 на эндоцитоз рецептора ЭФР 56
4.3. Влияние MG132 на динамику компартментализации ЭФР-рецепторных комплексов 58
4.4. Исследование возможного влияния MG132 на функционирование лизосом 64
4.5. Влияние ингибиторов протеасом и ингибитора вакуолярной протонной помпы Баф А1 на убиквитинирование клеточных белков 67
4.6. Влияние ингибитора протеасом MG132 на убиквитинирование рецептора ЭФР и его взаимоотношения с убиквитин-лигазой с-СЫ 69
4.7. Анализ поведения рецептора ЭФР, ассоциированного с убиквитин-лигазой с-СЫ, во фракциях ранних и поздних эндосом/лизосом 75
4.8. Участие РІЗ-киназ I и III классов в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР 80
4.9. Взаимоотношение убиквитин-лигазы с-СЫ и РІЗК в процессе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов 83
5. Обсуждение 85
Выводы 96
