Введение
Обзор литературы 11
Классические эмульсионные методы ультравысокопроизводительного скрининга активности 11
Микрофлюидные технологии для генерации монодисперсных эмульсий и инкапсуляции единичных живых клеток и организмов 17
Микрофлюидные технологии для ультравысокопроизводительного скрининга 26
Использование рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в качестве антидота при отравлении фосфорорганическими токсинами 39
Скрининг антибиотической активности 45
Материалы и методы 53
Химические реактивы и сопутствующие материалы 53
Реактивы 53
Ферменты 53
Субстраты 53
Маркеры 54
Поверхностно-активные вещества 54
Фосфорорганические соединения 54
Антитела 54
Активированные эфиры флуорофоров 54
Плазмидные вектора 54
Бактериальные штаммы 54
Дрожжевые штаммы 55
Клеточные линии 55
Животные 55
Растворы 55
Бактериальные среды 55
Дрожжевые среды 56
Антибиотики 56
Методы работы с нуклеиновыми кислотами 56
Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции 56
Рестрикция 57
Лигирование 57
Выделение плазмидной ДНК 58
Электрофорез ДНК в агарозном геле 58
Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле 59
Электроэлюция 59
Секвенирование плазмидной ДНК 59
Создание генетических конструкций для продукции 4рчБуХЭ 60
Создание генетических конструкций для дрожжевого дисплея ферментов 61
Создание библиотеки мутантов БуХЭ 62
Создание генетических конструкций для продукции мутантов БуХЭ 62
Методы работы с бактериями E. coli 63
Получение электрокомпетентных клеток 63
Трансформация клеток E. coli методом электропорации 63 ПЦР c колоний Ночная культура 64
Приготовление музейного штамма 64
Методы работы с дрожжами Pichia рastoris 64
Получение электрокомпетентных клеток 64
Трансформация клеток методом электропорации 65
ПЦР с генома дрожжей 65
Анализ трансформантов 66
Приготовление музейного штамма 66
Экспрессия белков, заякоренных на поверхности дрожжевой стенки, для проведения процедуры микрофлюидной компартментализации 66
Методы работы с клетками линии CHO-K1 и FreeStyle 293-F 67
Культивирование клеток линии CHO-K1 67
Получение стабильных клонов-продуцентов 4рчБуХЭ 67
Продукция рчБуХЭ в клетках линии CHO-K1 69
Культивирование клеток линии FreeStyle 293-F и заморозка 70
Трансфекция клеток линии FreeStyle 293-F методом липофекции 70
Продукция мутантной рчБуХЭ в клетках линии FreeStyle 293-F 71
Методы работы с белками 71
Электрофорез в полиакриламидном геле 71
Окрашивание ПААГ Кумасси синим R-250 с усилением контраста солью меди 72
Окрашивание ПААГ на наличие бутирилхолинэстеразной активности по методу Карновского 72
Определение концентрации рчБуХЭ 72
Выделение и очистка 4рчБуХЭ 73
Выделение и очистка мутантов рчБуХЭ 74
Химическое полисиалирование препаратов рчБуХЭ 75
Введение радиоизотопной метки 125I в препараты рчБуХЭ 75
Получение препаратов флуоресцентно меченой 4рчБуХЭ 75
Оценка кинетических характеристик мутантов БуХЭ, устойчивых к ингибированию ФОТ 76
Методы работы с животными 77
Животные, уход за животными 77
Определение фармакокинетических параметров препаратов рчБуХЭ и конъюгатов рчБуХЭ-ПСА 77
Определение профиля биораспределения препарата 4рчБуХЭ и конъюгата 4рчБуХЭ ПСА 78
Определение профиля биодеградации препарата 4рчБуХЭ in vivo 78
Оценка протективного действия препарата 4рчБуХЭ 79
Микрофлюидная платформа для ультравысокопроизводительного скрининга биокаталитической и антимикробной активности 80
Изготовление микрофлюидных чипов 80
Установка для генерации монодисперсной микрофлюидной эмульсии 81
Инкапсуляция дрожжевых клеток и проведение ферментативных реакций в каплях 81
Инкапсуляция клеток бактерий и культивация в каплях 82
Визуализация капель 82
Отбор капель двойной микрофлюидной эмульсии с использованием FACS и регенерация клеток из капель 83
Отбор мутантов БуХЭ с различным уровнем активности 83
Отбор мутантов БуХЭ, устойчивых к инактивации ФОТ 84
Отбор представителей микробиоты ротовой полости, ингибирующих рост S. aureus Регенерация и идентификация культивируемых бактерий-ингибиторов S. aureus 85 Отбор бактерий-ингибиторов S. aureus с использованием классических микробиологических подходов скрининга на чашках (платформы Ваксмана) 86
Измерение ингибирующих свойств метаболитов в жидкой культуре 86
Очистка и идентификация действующих веществ Pseudomonas aeruginosa 86
16S рРНК секвенирование бактерий 87
Полногеномное секвенирование бактерий 88
Результаты и обсуждение 89
Создание микрофлюидной платформы для ультравысокопроизводительного скрининга биокаталитической и антибактериальной активности в каплях микрофлюидной двойной эмульсии 89
Скрининг биокаталитической активности в каплях микрофлюидной двойной эмульсии 94
Дрожжевой дисплей биокатализаторов и высокочувствительная детекция биокаталитической активности 94
Эффективность отбора биокатализаторов из смеси активных и неактивных клеток 97
Селективность отбора биокатализаторов из смеси биокатализаторов с разной специфичностью или различным уровнем активности 100
Отбор мутантов БуХЭ, устойчивых к действию ФОТ 104
Улучшение фармакокинетических характеристик рчБуХЭ за счет ее продукции исключительно в виде тетрамера 107
Создание генетических конструкций нового поколения для высокоэффективной продукции 4рчБуХЭ 107
Изучение фармакокинетичеких характеристик и профиля биораспределения 4рчБуХЭ, а также влияния химического полисиалирования 110
Изучение профиля биодеградации 4рчБуХЭ in vivo 115
Протективное действие препарата 4рчБуХЭ 119
Скрининг антибактериальной активности в каплях микрофлюидной двойной эмульсии 122
Создание модельной системы для изучения попарных взаимодействий микроорганизмов 122
Скрининг представителей микробиоты ротовой полости, ингибирующих рост S. aureus 126
Выводы 135
Список литературы
