Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Фитогормоны брассиностероиды 9
1.1.1. Структура и функции брассиностероидов 9
1.1.2. Молекулярные механизмы действия брассиностероидов в клетках растений 12
1.2. Фосфорилирование/дефосфорилирование белков растений. 16
1.2.1. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции метаболизма азота и углерода 17
1.2.2. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции ферментов энергетического метаболизма 22
1.2.3. Участие фосфорилирования белков растений в реіуляции активности структурных белков 22
1.2.4. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции клеточного цикла 23
1.2.5. Участие фосфорилирования белков в регуляции сигнальных систем клеток растений 27
1.2.6. Участие фосфорилирования белков в регуляции фотосинтеза 30
1.2.7. Участие фосфорилирования белков в регуляции других процессов клеток растений 32
1.3. Тирозиновое фосфорилирование белков растений 33
1.3.1. Тирозиновые протеинкиназы и протеинфосфатазы растений 33
1.3.2. Роль тирозинового фосфорилирования белков в регуляции функционирования клеток растений 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Объекты исследования 39
2.2. Определение общего фосфорилирования белков листьев гороха in situ 39
2.3. Определение тирозинового фосфорилирования растворимых белков листьев гороха методом Вестерн-блотинга с использованием моноклональных антител PY20 к фосфотирозиновым белкам 41
2.3.1. Приготовление образцов 41
2.3.2. Метод полусухого блотирования (Вестерн-блотинг) 41
2.3.3. Иммунодетекция тирозинового фосфорилирования белков...42
2.3.4. Детектирование хемилюминесценции 42
2.4. Одномерный электрофорез по методу Laemmli 43
2.5. Двумерный электрофорез 44
2.6. Анализ данных, полученных с помощью методов одномерного и двумерного электрофореза 44
2.7. Идентификация белков методом MALDI-TOF MS 44
2.7.1. Трипсинолиз белкового образца 44
2.7.2. Регистрация масс-спектров 45
2.7.3. Идентификация белков 45
2.8. Определение содержания перекиси водорода в клетках корней гороха 45
2.9. Определение содержания оксигенированных производных линолевой кислоты in vitro в листьях гороха 46
2.10. Определение количества белка в растворе по методу Бредфорда 47
2.11. Химические реактивы и материалы 48
Глава 3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Влияние эпибрассинолида на общее фосфорилирование растворимых белков листьев гороха 49
3.1.1. Временная зависимость действия эпибрассинолида на общее фосфорилирование белков in situ 49
3.1.2. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном общем фосфорилировании белков 49
3.2. Влияние эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев гороха 52
3.2.1. Изучение специфичности связывания антител PY20 с растворимыми фосфотирозиновыми белками гороха 52
3.2.2. Временная зависимость влияния эпибрассинолида in situ на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев 54
3.2.3. Влияние эпибрассинолида и ингибиторов тирозиновых фосфатаз (ортованадата натрия и оксида фениларсена) in situ на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха 57
3.2.4. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированномтирозиновом фосфорилировании белков листьев гороха 66
3.3. Идентификация белков листьев гороха, тирозиновое фосфорилирование которых изменялось под влиянием эпибрассинолида 71
3.4. Влияние эпибрассинолида на содержание перекиси водорода в клетках корней гороха 85
3.5. Влияние эпибрассинолида на содержание оксигенированных производных линолевои кислоты в листьях гороха 86
Заключение 90
Выводы 92
Список использованной литературы 93
