Введение
1. Обзор литературы 12
1.1.Нуклеазы 12
1.1.1. Нуклеаза Serratia marcescens 13
1.1.2. Нуклеаза Anabaena sp. 19
1.2. Ферменты, участвующие в структурной организации ДНК
(топоизомеразы) 22
1.2.1. ДНК-гираза 23
1.3. Клонирование генов 28
2. Материалы и методы 39
2.1. Материалы исследования 39
2.2. Получение компетентных клеток
2.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока 41
2.4. Выделение плазмидной ДНК 42
2.5. Электрофорез в агарозном геле 43
2.6. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA 44
2.7. ХО -электрофорез в полиакриламидном геле 44
2.8. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA с помощью индикаторного агара 46
2.9. Определение динамики роста рекомбинантных штаммов Kcoli LK111A и E.coli TGE900 47
2.10. Конструирование референс-плазмидырЕТсосоАтрСт 47
2.11. Реакция рестрикции - 48
2.12. ДНК-лигазная реакция 50
2.13. Амплификация фрагментов гена Ыа с помощью ПНР 50
2.14. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика 51
2.15. Определение количества р-лактамазы 51
2.16. Определение частоты спонтанной элиминации плазмид 53
2.17. Статистическая обработка результатов 53
3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Получение рекомбинантных штаммов Е. coliLKlllA и Е. coli TGE900 55
3.2. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. 57
3.3. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. с помощью индикаторного агара 59
3.4. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Seiratia marcescens и Anabaena sp. на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LKlllXviE. coli TGE900 63
3.5. Определение уровня устойчивости к ампициллину для рекомбинантных штаммов Е. coli LK111А и Е. coli TGE900 68
3.6. Получение референс-плазмидырЕТсосоАтрСт 73
3.6.1. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт 74
3.6.2. Определение дозы гена Ыа в рекомбинантном штамме E.coli DH5a рЕТсосоАтрСт 16
Ъ.1. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах E.coli LK111X и E.coli TGE900 80
3.8. Определение стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 87
3.9. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов E.coli LK11 IX и Е. coli TGE900 к антибиотикам ингибиторам репликации ДНК 93
Заключение 100
Выводы 105
Список использованных источников литературы 1
