Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Гомоцистеин 10
1.1.1. Метаболизм гомоцистеина 10
1.1.2. Причины повышения концентрации гомоцистеина в плазме крови 12
1.1.3. Гомоцистеин как фактор риска 13
1.2. Глутаматные рецепторы как возможная мишень для действия ГЦ 16
1.2.1. Общая характеристика глутаматных рецепторов 16
1.2.2. NMDA-рецептор: структура и функции 20
1.2.3. Нейропротекторный и экзайтотоксический пути активации NMDA-рецепторов .23
1.3. Влияние ГЦ на клетки крови. Нейтрофилы 25
1.3.1. Общая характеристика нейтрофилов 26
1.3.2. Функциональная активность нейтрофилов 27
1.3.3. Системы генерации АФК в нейтрофилах 29
1.3.3.1. NADPH-оксидаза – источник АФК в нейтрофилах 30
1.3.3.2. Миелопероксидаза 35
1.3.4. Рецепторы нейтрофилов 39
II. Материалы и методы исследования 45
11.1. Выделение нейтрофилов 45
11.1.1. Выделение нейтрофилов из периферической крови 45
11.1.2. Выделение активированных in vivo нейтрофилов 45
11.2. Выделение суспензии нейронов из мозжечка крыс 46
11.3. Подсчет клеток в камере Горяева 46
11.4. Опсонизация зимозана 47
11.5. Хемилюминометрический метод регистрации активных форм кислорода 48
11.6. Определение активности коммерческого препарата миелопероксидазы человека 49
11.6.1. Измерение продукции гипохлорита в ходе реакции, катализируемой препаратом миелопероксидазы 49
11.6.2. Спектрофотометрический метод измерения активности миелопероксидазы 49
11.6.3. Исследование возможности прямого взаимодействия гомоцистеина с гипохлоритом 50
11.7. Исследование клеток методом проточной цитометрии 50
11.7.1. Принцип метода проточной цитометрии 50
11.7.2. Побор оптимальных условий выделения нейтрофилов из общей лейкомассы на среде MonoPoly 52
II.7.3. Получение очищенной суспензии интактных нейтрофилов 53
11.7.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 54
11.8. Идентификация белковых субъединиц NMDA-рецептора 56
11.8.1. Лизис клеток и иммунопреципитация белка 56
11.8.2. Разделение белков методом электрофорез в SDS-полиакриламидном геле 56
11.8.3. Вестерн блоттинг 58
II.8.4. Идентификация белка методом усиленной хемилюминесценции (ECL) 59
11.9. ПЦР 60
11.9.1 Индукция экспрессии мРНК для NR1 субъединицы NMDA-рецептора 60
11.9.2 Выделение тотальной РНК 61
11.9.3. Получение кДНК в реакции обратной транскрипции 62
11.9.4. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) 62
11.10. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах 64
11.10.1. Принцип метода 64
11.10.2. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах 65
11.11. Статистическая обработка результатов 66
III. Результаты и их обсуждение 67
111.1. Исследование действия гомоцистеина на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными in vivo нейтрофилами 67
111.2. Исследование механизмов антиоксидантного эффекта ГЦ 71
111.2.1. Ферментативные системы нейтрофилов, отвечающие за генерацию АФК 71
111.2.2. Изучение влияния ГЦ на коммерческий препарат миелопероксидазы 72
III.2.2.1 Влияние ГЦ на активность МПО, измеренную хемилюминесцентным
методом.. 72
111.2.2.2. Исследование прямого взаимодействия ГЦ с гипохлорит-анионом 75
111.2.2.3. Влияние ГЦ и других серосодержащих соединений на активность МПО, измеренную в присутствии о-дианизидина.. 76
111.3. Исследование возможности рецепторного воздействия ГЦ на нейтрофилы 80
111.3.1. Определение экспрессии мРНК к NR1 субъединице NMDA-рецепторного комплекса 80
111.3.2. Идентификация субъединиц NMDA-рецептора в активированных in vivo нейтрофилах 83
111.3.3. Исследование экспрессии NR2B субъединицы NMDA-рецептора на поверхности интактных и активированных in vivo нейтрофилов 85
111.3.4 Исследование роли NMDA-рецепторов в ГЦ-индуцируемом усилении продукции АФК активированными in vivo нейтрофилами 87
111.3.5 Исследование возможного механизма реализации действия ГЦ на
активированные in vivo нейтрофилы через NMDA-рецепторы 89
111.4. Исследование других возможных путей реализации эффекта гомоцистеина 91
111.4.1. Изучение роли метаботропных глутаматных рецепторов в реализации 92
действия ГЦ 92
111.4.2. Изучение роли аденозиновых рецепторов в реализации действия ГЦ 94
IV. Заключение 97
Выводы 101
Благодарности 102
Список литературы
