Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов 10
1.1.1. Метилирование ДНК 12
1.1.2. Модификации гистонов 18
1.1.3. РНК – интерференция 23
1.1.4. Реализация эпигенетического молчания или взаимосвязь механизмов эпигенетической регуляции 27
1.2. Химический канцерогенез 30
1.2.1. Генотоксические и эпигенетические канцерогены 34
1.2.2. Влияние химических канцерогенов на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов 44
2. Материалы И Методы 53
2.1. Клеточные культуры 53
2.2. Плазмидные векторы 53
2.3. Получение вирусного стока, инфицирование и анализ GFP экспрессии. 54
2.4. Выделение субпопуляции клеток, содержащей эпигенетически инактивированный геном вируса саркомы птиц 54
2.5. Трансфекция с использованием двухцепочечных олигонуклеотидных РНК-дуплексов (siRNA) 57
2.6. Определение белка методом Вестерн-блоттинг 58
2.7. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) 59
2.8. Количественная ПЦР в реальном времени 60
2.9. Анализ метилирования методом бисульфитного секвенирования 61
2.10. Анализ метилирования методом ELISA 62
2.11. Анализ метилирования методом метилчувствительной ПЦР.. 63
2.12. Статистическая обработка данных 64
3. Результаты исследования 65
3.1. Характеристика модельной системы 65
3.1.1. Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических соединений .. 65
3.1.2. Определение гистоновых модификаций на промоторе и гене GFP 68
3.1.3. Анализ метилирования ДНК интегрированного провируса 70
3.2. Реактивирующее действие химических соединений 74
3.2.1. Реактивирующее действие эпигенетических препаратов. 74
3.2.2. Тестирование химических соединений на модели HeLa-TI 75
3.2.3. Влияние химических соединений на общий уровень гистоновых модификаций.. 80
3.2.4. Изменение общего уровня метилирования 82
3.2.5. Влияние химических соединений на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI при реактивации экспрессии GFP в результате обработки химическими соединениями.. 83
3.3. Изучение эпигенетических эффектов узкобороздочных лигандов 85
3.3.1. Анализ реактивирующего действия узкобороздочных лигандов 85
3.3.2. Влияние УБЛ на гистоновые модификации в модельной системе HeLa-TI 86
3.3.3. Влияние УБЛ на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI 88
3.4. Взаимосвязь процессов модификации гистонов и ДНК метилирования 89
3.4.1. Совместное действие УБЛ и эпигенетических ингибиторов 89
4. Обсуждение результатов 94
4.1. Особенности используемой модельной системы 94
4.1.1. Распределение гистоновых модификаций на интегрированном векторе 96
4.1.2. Метилирование ДНК интегрированного провируса 99
4.2. Реактивирующее действие канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков 102
4.3. Действие узкобороздочных лигандов 111
4.4.Синергическое действие химических препаратов 115
Заключение 119
Выводы 121
Список цитируемой литературы
