Введение
Обзор литературы 12
Патогенез травматических повреждений нервов 12
Актуальность проблемы 12
Краткий обзор устройства периферической нервной системы млекопитающих 13
Патогенез травматических повреждений нервов 16
Факторы, стимулирующие рост и регенерацию нервных волокон 21
Факторы, определяющие успешную регенерацию периферического нерва 41
Существующие подходы к терапии поврежденных нервов 45
Перспективные подходы к терапии поврежденных нервов 47
Мезенхимальные стволовые клетки 53
Характеристика мезенхимальных стволовых клеток 53
Роль МСК в тканях 61
МСК- перспективный материал для клеточной терапии и тканевой инженерии 65
Возможные механизмы, благодаря которым МСК стимулируют регенерацию тканей 68
Материалы и методы исследования 72
Животные 72
Культура мезенхимальных стволовых клеток 72
Выделение тотальной РНК 74
Денатурирующий электрофорез РНК в агарозно-формальдегидном геле 75
Транскриптомный анализ 76
Модель повреждения периферического нерва 76
Методы оценки эффективности регенерации периферического нерва 78
Оценка восстановления функции двигательных нервных волокон 79
Оценка восстановления проводимости нерва (электрофизиологическое исследование) 80
Оценка восстановления структуры поврежденного нерва (иммунногистохимическое исследование) 83
Оценка восстановления структуры поврежденного нерва (гистохимическое окрашивание срезов нерва Судановым черным) 84
Имплантация МСК на поврежденный нерв 85
Получение плазмидной конструкции для экспрессии мозгового фактора роста нервов 87
Выделение плазмидной конструкции pVax1-hBDNF 91
Электрофорез генетической конструкции pVax1-hBDNF в агарозном геле 92
Тестирование полученной плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF 93
Анализ наличия кДНК BDNF в плазмидной конструкции с помощью полимеразной цепной реакции 93
Анализ эффективности экспрессии плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF в эукариотических клетках 94
Иммуноферментный анализ кондиционированной среды 94
Доставка плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF в мышцы 95
Анализ эффективности экспрессии BDNF в мышечных волокнах 99
Статистическая обработка данных 99
Результаты исследования 101
МСК стимулируют функциональное и структурное восстановление поврежденного периферического нерва 101
МСК экспрессируют факторы роста и компоненты матрикса, необходимые для роста аксонов, а также компоненты миелина 108
Блокирующие антитела к факторам роста, продуцируемым МСК, подавляют способность МСК стимулировать восстановление функции и структуры
поврежденного периферического нерва ПО
Оптимальный метод доставки генетических конструкций в мышечные волокна 120
Вектор pVaxl-hBDNF экспрессируется в эукариотических клетках и мышечных эксплантах 124
Генетическая конструкция pVax1-hBDNF содержит кДНК hBDNF 124
Генетическая конструкция pVax1-hBDNF экспрессируется в клетках линии НЕК293Т 125
Максимально эффективная экспрессия hBDNF в мышечных волокнах может быть достигнута инъекцией 200 мкг pVax1-hBDNF 126
Максимально эффективное восстановление структуры и функции поврежденного нерва наблюдается после инъекции 200 мкг pVax1-hBDNF 127
Генетическая конструкция pVax1-BDNF стимулирует восстановление функции и структуры периферического нерва после травмы 132
Обсуждение результатов исследования 136
Выводы 146
Список литературы 148
