Введение
Обзор литературы 9
1. 1. Методы микроинъекции (МИ) 9
1. 2. Выживаемость зародышей животных и
человека после МИ 11
1. 3. Ранний эмбриогенез мыши, стадия бластоцисты 12
1. 4. Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей 19
1. 5. Роль цитокина LIF в эмбриогенезе и имплантации 22
1. 6. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши 26
1. 7. Методы получения ЭСК 30
1. 8. Химерные зародыши и животные 34
ГЛАВА II 40
Материал и методы 40
2. 1. Биологический материал 40
2. 2. Ранние зародыши мыши 40
2.2.1. Выделение зародышей на стадии бластоцисты 40
2.2.2. Культивирование бластоцист in vitro 41
2.2.3. Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты 41
2. 3. Клеточные культуры 42
2.3.1. Выделение первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши 42
2.3.2. Культивирование клеток ПЭФ 43
2.3.3. Приготовление митомицинового фидера ПЭФ 43
2.3.4. Культивирование ЭСК мыши 44
2.3.5. Культивирование и трансфекция клеток линии Cos-1 44
2. 4. Микроинъекция (МИ) 45
2.4.1. Оборудования для проведениями 45
2.4.1. МИ в бластоцисты растворов и целых клеток 46
2. 5. Оценка жизнеспособности бластоцист мыши в условиях культуры in vitro 47
2.5.1. Цитохимический тест на выявление эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ) 48
2.5.2. Иммуноцитохимическое определение фактора транскрипции плюрипотентных клеток - Nanog 49
2. 6. Криоконсервация клеточных культур 49
2.6.1. Замораживание и хранение ЭСК,
ПЭФ и Cos-1 в жидком азоте 49
2.6.2. Режимы замораживания и размораживания клеточных культур 50
2. 7. Состав сред и растворов, используемых для культивирования клеток и ранних зародышей 50
2.7.1. Модифицированная среда Виттена (МСВ) 50
2.7.2. Фосфатно-солевой буфер PBS 51
2.7.3. Раствор Версен-ЭДТА 51
2.7.4. Трипсин-ЭДТА 51
2. 8. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА III 52
Результаты и обсуждение 52
3.1. МИ в полость бластоцисты среды Виттена и витальных красителей 52
3.1.1. Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ 52
3.1.2. Развитие зародышей мыши со стадии бластоцисты in vitro 60
3.1.3. Межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист после МИ 66
3.1.4. Влияние цитохалазина Б на эффективность культивирования мышиных бластоцист 71
3.1.5. Повышение эффективности культивирования бластоцист мышей в среде с цитокином LIF 73
3.1.6. МИ цитокина LIF в полость бластоцисты 78
3. 2. Получение химерных бластоцист мыши 82
3.2.1. Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ 83
3.2.2. МИ в полость бластоцисты трансфицированных клеток линии Cos-1 85
3.2.3. Оценка флуоресценции зеленого белка GFP в первичных эмбриональных фибробластах (ПЭФ) мыши после МИ в бластоцисту 90
3.2.4. Эффективность развития химерных бластоцист мыши в культуре 94
Глава IV 97
Выводы 97
Список литературы
