Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Жизненный цикл вируса гепатита В 13
1.2. Вирусный цикл на моделях ВГВ in vitro и in vivo 22
1.3. Подходы к лечению хронической инфекции и использование системы CRISPR/Cas9 в элиминации кольцевой ковалентно-замкнутой ДНК вируса гепатита В 25
1.4. Пути репарации двуцепочечных разрывов ДНК NHEJ и HR и способы изменения их активности 30
1.5. Факторы, модулирующие активность путей репарации 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Плазмиды 37
2.1.1. Приготовление среды LB и чашек с агаром 37
2.1.2. Выделение и очистка плазмид 38
2.2. Синтез ПЦР-продуктов 38
2.3. Выделение нуклеиновых кислот 41
2.3.1. Выделение ДНК ВГВ 41
2.3.2. Выделение ккзДНК и пгРНК 41
2.3.3. Выделение пгРНК ВГВ 42
2.4. Измерение чистоты и концентрации нуклеиновых кислот 42
2.5. Количественный ПЦР анализ в реальном времени 43
2.6. ПЦР в режиме реального времени с зондами ТaqMan 44
2.7. Клеточные культуры 45
2.8. Получение лентивирусных частиц с системами CRISPR/Cas9 47
2.9. Определение титра лентивирусов 48
2.10. Растворы низкомолекулярных соединений 48
2.11. Количественное определение секретируемого HBs-антигена вируса 49
2.12. Иммуноцитохимический анализ 49
2.13. Анализ клеточного цикла 51
2.14. Анализ апоптоза 51
2.15. Микроскопирование 52
2.16. Секвенирование 53
2.17. Статистическая обработка данных 54
Глава 3. Сравнительный анализ вирусного цикла на моделях ВГВ in vitro 55
Глава 4. Влияние модуляторов путей репарации NHEJ/HR на жизненный цикл вируса гепатита В 58
Глава 5. Оценка цито- и генотоксических эффектов низкомолекулярных соединений 61
Глава 6. Противовирусное действие в условиях модуляции путей репарации NHEJ/HR 69
Глава 7. Низкомолекулярное соединение NU7026 вызывает гиперредактирование ККЗДНК после действия CRISPR/CAS9 77
Обсуждение 87
Заключение 92
Выводы 93
Список сокращений 94
Список литературы 96
