Введение
1. Повреждения остатков гуанина в ДНК 9
1.1. Повреждение ДНК активными формами кислорода 9
1.1.1. Структура ДНК, содержащей 8-oxoG 11
1.1.2. Репарация 8-охоО-ДНК 12
1.1.3. Влияние 8-oxoG на процессы, протекающие в клетке 14
1.2. Повреждение ДНК метилирующими агентами 18
1.2.1. Структура ДНК, содержащей 06meG 19
1.2.2. Ответ клетки на присутствие 06meG в ДНК 21
1.2.3. Цитотоксичность 06meG 22
1.3. Действие на ДНК бензо[а]пирена — канцерогенного полициклического ароматического углеводорода 25
1.3.1. Структура ДНК, содержащей (+)-транс- и (+)-^мс-В[а]Р-Л^~-сЮ-аддуктьі 27
1.3.2. Репарация В[я]Р-ДНК 31
1.3.3. Взаимодействие В[а]Р-ДНК с ДНК-связывающими ферментами 32
2. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование ДНК- метилтрансфераз SssI (Spiroplasmd) и Dnmt3a (мыши) 36
2.1. Взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК, содержащей 8-oxoG 38
2.1.1. Выделение Dnmt3a-CD и M.SssI 38
2.1.2. Дизайн и характеристика аналогов субстратов 39
2.1.3. Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG 40
2.1.4. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 8-oxoG 43
2.1.5. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG 49
2.1.6. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG 54
2.1.7. Молекулярные основы влияния 8-oxoG на взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК 56
2.2. Взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК, содержащей 06meG 58
2.2.1. Используемые ДНК-дуплексы 58
2.2.2. Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 06meG 60
2.2.3. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 06meG 63
2.2.4. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих О meG 64
2.2.5. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 06meG 66
2.2.6. Молекулярные основы влияния 06meG на взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК 67
2.3. Взаимодействие M.SssI с ДНК, содержащей (+)-ifitc-B[a]?-N2-dG 69
2.3.1. Связывание M.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими (+)-ifuc-B[a]P-N -dG 70
2.3.2. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих (+)-ifitc-B[a]P-N -dG 73
2.3.3. Сравнение влияния (+)-цис- и (+)-mpciHC-B[a\P-N -dG-аддуктов на функционирование M.SssI 75
2.4. Заключение 78
3. Экспериментальная часть 79
3.1. Реактивы и материалы 79
3.2. Приборы и методы 82
3.3. Общие методики 84
3.3.1. Формирование ДНК-дуплексов 84
3.3.2. Плавление ДНК-дуплексов 84
3.3.3. Приготовление компетентных клеток 85
3.3.4. Выделение Dnmt3a-CD 86
3.3.5. Выделение M.SssI 87
3.3.6. Ферментативное 5-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов 87
3.3.7. Выделение олигонуклеотидов из геля 88
3.3.8. Определение концентрации активных молекул M.SssI с помощью метода поляризации флуоресценции 88
3.3.9. Определение Ка комплексов Dnmt3a-CD с ДНК и AdoIIcy с помощью метода поляризации флуоресценции 88
3.3.10. Определение Ка комплексов M.SssI с ДНК и AdoHcy методом равновесного конкурентного связывания с ферментом двух различных ДНК-дуплексов с помощью «торможения» в геле 90
3.3.11. Определение начальных скоростей метилирования Dnmt3a-CD 30-ти звенных ДНК-дуплексов 92
3.3.12. Метилирование Dnmt3a-CD 30-ти звенных ДНК-дуплексов в условиях «одного оборота» (интегральная кинетика метилирования) 92
3.3.13. Определение начальных скоростей метилирования M.SssI 30-ти звенных ДНК-дуплексов 93
3.3.14. Определение начальных скоростей и каталитических констант скорости реакции метилирования M.SssI В[а]Р-содержащих ДНК-дуплексов 94
Выводы 95
