Введение
Часть I. Обзор литературы 6
1. Путь биосинтеза L-пролина 6
1.1. у-Глутамилкиназа 8
1.2. у-Глутамилфосфатредуктаза 9
1.3. Пирролин-5-карбоксилатредуктаза 10
1.4. Обходной путь образования Ь-глутамат-5-полуальдегида в клетках Е. 11 coli
1.5. Организация генов пути биосинтеза пролина 12
1.6. Пары токсин-антитоксин 13
1.7. Регуляция пути биосинтеза пролина 15
2. Транспорт и деградация пролина 19
2.1. Транспорт пролина и осморезистентность 19
2.2. Деградация пролина 20
3. Продуценты пролина 21
4. Предшественники пролина 24
4.1. Глутаминовая кислота - структурный предшественник пролина 24
4.1.1. Глутаматдегидрогеназа 25
4.1.2. Глутаматдекарбоксилазы 26
4.2. а-Кетоглутаратдегидрогеназа. 27
4.3. Фосфопируваткарбоксилаза 29
Часть П. Материалы И Методы 32
1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды и среды 32
1.1. Получение мутантов 35
1.2. Получение мутантов, резистентных к структурным аналогам пролина. 35
2. Методы и ферменты, использованные при работе с ДНК 35
2.1. Трансформация, трансдукция, клонирование in vivo 36
3. Ферментации 36
3.1. Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости 36
4. Определение активностей ферментов
4.1. Приготовление экстрактов клеток для определения активности ферментов 37
4.2. Определение активности у-глутамилкиназы (ГК) 37
4.3. Определение активности у-глутамилфосфатредуктазы (ГФР) 38
4.4. Определение активности Д-пирролин^-карбоксилатредуктазы 38 (ПКР)
4.5. Определение активности фосфопируваткарбоксилазы (ФПК) 39
4.6. Определение активности а-кетоглутаратдегидрогеназы 40
4.7. Определение активности глутаматдегидрогеназы (ГДГ) 41
5. Использованные программы компьютерного анализа. 41
Часть III. Результаты И Обсуждения 42
1. Усиление биосинтеза L-пролина в штамме Е. coli К12 за счет снятия 42 ретроингибирования ферментов этого пути, амплификации содержащих необходимые мутации генов пути биосинтеза пролина, а также блокирования известных путей деградации L-пролина.
1.1. Селекция и свойства полученных аналогорезистентных мутантов штамма E.coli К12 - продуцентов пролина.
1.2. Получение ауксотрофных мутантов Е. coli К12 по L-пролину пенициллиновым методом обогащения.
1.3. Клонирование in vivo фрагментов хромосомы Е. coli, комплементирующих пролиновую ауксоторофность.
1.4. Минимизация фрагмента хромосомы штамма 240-18, содержащегоргоВ*А оперон.
1.5. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами Ь0245 nyaffV.
1.6. Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина . 53
1.7. Идентификация мутации в генергаВ*. 56
1.8. Результаты амплификации генов пути биосинтеза пролина в клетках 60 штамма Е. coli 240-18.
2. Оптимизация уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты участвующие в синтезе предшественников пролина.
2.1. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 дополнительных копий гена gdhA.
2.2. Анализ потоков распределения углерода штаммах c амплифицированными генами ргоВ*А и gdhA с помощью ЯМР спектроскопии.
2.3. Оптимизация уровня экспрессии генов sucAB путем замены и нативного промотора в составе бактериальной хромосомы.
2.4. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 генаррс. 76 Определение оптимальной активности фосфоенолпируваткарбоксилазы в клетке для биосинтеза пролина.
2.5. Роль глутаматдеркарбоксилазы в пути биосинтеза L-пролина.
Список литературы 89
