Введение
Глава 1. Обзор литературы. 9
1.1 Современные представления о плазматических мембранах. Многообразие внутриклеточных путей.
1.2 Внутриклеточный транспорт рицина. 19
1.3 Эпидермальный фактор роста и трансферрин 23
1.4 Рецепторы эпидермального фактора роста и трансферрина. 26
1.5 Внутриклеточный транспорт TFR и EGFR. 32
1.6 Современные подходы к синтезу и использованию препаратов направленного действия . 39
Заключение. 42
Глава 2. Материалы и методы. 45
2.1 Материалы. 45
2.2 Методы. 45
2.2.1. Клеточные линии. 45
2.2.2 Получение гибридом. 46
2.2.3 Системы ТИФА. 47
2.2.3.1 Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами .
2.2.3.2. Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина. 47
2.2.4 Биотинилирование белков. 48
2.2.5 Очистка моноклональных антител (мАт). 49
2.2.6 Иммобилизация мАт 2RBK1 на BrCN-активированную сефарозу 4В. 50
2.2.7 Дополнительная очистка RTA. 51
2.2.8 Клеточные лизаты и супернатанты. 51
2.2.9 Трансфекция клеток линий А431. 51
2.2.10 Электрофорез в ПААГ. 52
2.2.11 Конъюгаты EGF-RTA и TF-RTA. 52
2.2.12 Получение конъюгатов трансферрина (Тф), epidermal growth factor (EGF), рицина и его субъединиц с различными флуорохромами . 53
2.2.13 Реассоциация субъединиц токсинов. 54
2.2.14 Цитотоксический тест. 55
2.2.15 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. 56
Глава 3. Результаты и обсуждение. 58
3.1. Гибридомы, продуцирующие моноклопальные антитела, дискриминирующие RTA от нативного токсина. 60
3.2 Дополнительная очистка субъединиц рицина. 63
3.3 Сравнительный анализ внутриклеточного распределения рицина и различных векторных молекул . 65
3.3. Цитотоксическая активность конъюгатов EGF-RTA и TF-RTA. 78
3.4 Сравнительный анализ взаимодействий рицина, вискумина и химерных молекул RTB-MLA и MLB-RTA с клетками. 80
3.4.1. Различия во взаимодействии рицина и вискумина с клеточной мембраной. 80
3.4.2. Цитотоксическая активность химерных молекул MLB- RTA и RTB-MLA. 89
Выводы. 92
Список литературы. 93
Благодарности 108
