ГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................... 5
Актуальность работы................................................................................................. 5
Цель и задачи исследования...................................................................................... 6
Положения выносимые на защиту............................................................................7
Научная новизна и теоретическая значимость работы........................................... 7
Практическая значимость.......................................................................................... 8
Апробация работы...................................................................................................... 8
Публикации................................................................................................................. 9
Объем и структура диссертационной работы........................................................ 11
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................... 12
ГЛАВА I. АМИНОКИСЛОТЫ. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ, СПОСОБЫ И
ОБЪЕМ ПРОИЗВОДСТВА......................................................................................12
1.1 История производства аминокислот............................................................12
1.2 Состояние рынка аминокислот.................................................................... 13
1.3 Стратегии системной метаболической инженерии микроорганизмов для
производства аминокислот................................................................................. 14
1.4 Методы создания штаммов-продуцентов аминокислот, сосредоточенные
на анализе метаболических путей..................................................................... 15
1.5 Инженерия использования источника углерода......................................... 15
1.6 Обогащение предшественников, устранение побочных продуктов и
блокирование деградации продуктов................................................................ 17
1.7 Усиление экспорта целевой аминокислоты в культуральную среду........ 18
1.8 Обеспечение необходимого пула кофакторов.............................................19
1.9 Подходы, основанные на системной биологии.......................................... 19
ГЛАВА II. ШТАММЫ ESCHERICHIA COLI ЛИНИИ B И ESCHERICHIA COLI
ЛИНИИ K12.............................................................................................................. 23
ГЛАВА III. АЦЕТИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ У БАКТЕРИЙ КАК СПОСОБ
РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА.................................................. 28
3.1. История открытия и изучения процесса ацетилирования............................. 30
3.2 Влияние процесса ацетилирования на клеточный метаболизм..................... 31
3.3 Изменение метаболизма бактериальных клеток путем ацетилирования
ферментов центрального метаболизма...................................................................32
3.4 Механизмы ацетилирования..............................................................................34
3.5 Доменная организация бактериальных протеинацетилтрансфераз...............38
3.6 Ацетилирование и устойчивость к антибиотикам...........................................39
3.7 Практическое применение................................................................................. 41
2
ГЛАВА IV. МИНИМИЗАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ АЦЕТАТА ПРИ
ФЕРМЕНТАЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ У ESCHERICHIA COLI...........................43
4.1 Подходы на уровне биопроцессов для минимизации образования ацетата. 45
4.2 Генетические подходы к минимизации образования ацетата........................ 47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................................... 49
ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................49
5.1 Работа с бактериальными культурами..............................................................49
5.2 Бактериальные штаммы и плазмиды................................................................ 50
5.3 Олигонуклеотиды, использованные в работе.................................................. 52
5.4 Конструирование плазмиды, несущей ген, кодирующий деацетилазу CobB
для коэкспрессии...................................................................................................... 54
5.5 Электротрансформация компетентных клеток E. coli.....................................54
5.6 Получение тест-культуры.................................................................................. 55
5.7 Получение препарата фага P1vir для трансдукции в клетки E. coli.............. 55
5.8 Интеграция фрагментов ДНК в бактериальную хромосому, с
использованием Red-зависимой системы рекомбинации бактериофага λ..........56
5.9 Оценка накопления L-аминокислот в культуральной среде...........................57
5.10 Идентификация ацетилированных аминокислотных остатков лизина в
белках.........................................................................................................................58
5.11 Клонирование генов patZ и cobB.....................................................................59
5.12 Очистка ферментов CobB и PatZ.....................................................................60
5.13 Ацетилирование ε-аминогрупп остатков лизина в целевых белках in vitro60
5.14 Деацетилирование ε-аминогрупп остатков лизина в целевых белках in vitro
61
5.15 Построение 3D-структур белков с аминокислотными заменами................ 61
5.16 Молекулярный докинг......................................................................................61
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................ 62
ГЛАВА VI. ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОГО
АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА ПРОДУКЦИЮ L-ТРЕОНИНА
ШТАММОМ-ПРОДУЦЕНТОМ ESCHERICHIA COLI......................................... 62
ГЛАВА VII. ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕССА ДЕАЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА
ПРОДУКЦИЮ L-ТРЕОНИНА ШТАММОМ-ПРОДУЦЕНТОМ ESCHERICHIA
COLI........................................................................................................................... 66
ГЛАВА VIII. ВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОЦЕССАХ
АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА КЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ И ПРОДУКЦИЮ
АМИНОКИСЛОТ.....................................................................................................77
ГЛАВА IX. ВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО NΕ-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА
ЭНЗИМАТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТ
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ESCHERICHIA COLI............................................................. 81
ГЛАВА X. ВЛИЯНИЕ НЕФЕРМЕНТАТИВНОГО NΕ-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ
3
НА ЭНЗИМАТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТ
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ESCHERICHIA COLI............................................................. 91
ГЛАВА XI. СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ
ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ШТАММАХ MG1655
И BL21(DE3)............................................................................................................. 94
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................101
ВЫВОДЫ.................................................................................................................... 102
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ........................ 103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................... 104
