1. Оглавление ....................................................................................................................................... 2
2. Введение .......................................................................................................................................... 4
2.1. Актуальность темы исследования и степень ее разработанности ...................................... 4
2.2. Цели и задачи ........................................................................................................................... 5
2.3. Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы ............................... 5
2.4. Методология и методы исследования ................................................................................... 6
2.5. Положения, выносимые на защиту ........................................................................................ 6
2.6. Личный вклад соискателя ....................................................................................................... 7
2.7. Степень достоверности и апробация результатов исследования ....................................... 7
3. Обзор литературы ......................................................................................................................... 10
3.1. Трансляция эукариот ............................................................................................................. 10
3.1.1. Общий обзор трансляции эукариот и её основные участники .................................. 10
3.1.2. Инициация эукариотической трансляции .................................................................... 14
3.1.3. Элонгация эукариотической трансляции ..................................................................... 16
3.1.4. Терминация эукариотической трансляции .................................................................. 17
3.1.5. Рециклинг рибосом у эукариот ..................................................................................... 24
3.2. События на стоп кодоне, альтернативные терминации трансляции ................................ 24
3.2.1. Сквозное чтение стоп кодонов ...................................................................................... 24
3.2.2. Сдвиг рамки считывания ............................................................................................... 25
3.2.3. Нонсенс-опосредованный распад мРНК (NMD) ......................................................... 25
3.3. Преждевременная терминация трансляции на смысловых кодонах ................................ 26
3.4. Условия, определяющие эффективность и механизм терминации трансляции ............. 27
3.5. Факторы, определяющие направление развития событий на стоп кодоне ...................... 29
3.5.1. тРНК, связывающиеся со стоп кодоном ...................................................................... 29
3.5.2. Количество и специфичность факторов терминации eRF1 и eRF3 и их
модификации ................................................................................................................................. 32
3.5.3. 5′ контекст стоп кодона и связывание пептидил-тРНК с рибосомным тоннелем ... 36
3.5.4. Трансляционные факторы в составе рибосомного комплекса .................................. 39
3.5.5. Тип стоп кодона .............................................................................................................. 40
3.5.6. 3′ контекст стоп кодона ................................................................................................. 41
3.5.7. Поли(А) хвост и его пространственное сближение со стоп кодоном ....................... 42
3
3.5.8. Обобщение данных о влиянии окружения стоп кодонов на терминацию трансляции
45
4. Материалы и методы .................................................................................................................... 48
4.1. Получение плазмид, используемых для получения модельных мРНК ............................ 48
4.2. Получение модельных мРНК ............................................................................................... 51
4.3. Валидация кэпирования мРНК ............................................................................................. 52
4.4. Получение аминоацилированных тРНК.............................................................................. 53
4.5. Выделение белков .................................................................................................................. 54
4.6. Вестерн-блот анализ .............................................................................................................. 56
4.7. Валидация и выделение радиоактивномеченного гептапетида, синтезированного
рибосомой .......................................................................................................................................... 56
4.8. Масс-спектрометрический анализ ....................................................................................... 57
4.9. Анализ активности нанолюциферазы .................................................................................. 58
4.10. Анализ ГТФазной активности .......................................................................................... 58
4.11. Гель-шифт анализ отжига антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК ...................... 58
4.12. Трансляция в бесклеточной системе трансляции ........................................................... 59
4.13. Termi-Luc анализ эффективности высвобождения пептида .......................................... 59
4.14. Реконструированная система эукариотической трансляции in vitro ............................ 61
4.15. Статистический анализ ...................................................................................................... 63
5. Результаты и их обсуждение ....................................................................................................... 64
5.1. Влияние 5′ контекста стоп кодона на эффективность терминации трансляции ............. 64
5.2. Влияние длины кодирующей последовательности и фактора eIF3 на эффективность
терминации трансляции ................................................................................................................... 73
5.3. Влияние типа стоп кодона и его 3′ контекста на эффективность терминации трансляции
и сквозное чтение ............................................................................................................................. 77
5.4. Влияние метилирования остатка глутамина GGQ мотива eRF1 на эффективность
терминации трансляции ................................................................................................................... 88
5.5. Структура 3′ нетранслируемой области ........................................................................... 105
5.6. Влияние длины поли(А) хвоста и фактора PABP на терминацию трансляции............ 107
5.7. Заключение .......................................................................................................................... 126
6. Выводы ......................................................................................................................................... 127
7. Список сокращений и условных обозначений ......................................................................... 128
8. Список литературы ..................................................................................................................... 130
9. Благодарности ............................................................................................................................. 160
