Введение
1 Обзор литературы
Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК человека 12
1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях 13
1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК 14
1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК 16
1.2 Происхождение фрагментов внеклеточной ДНК в организме 17
1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК 1.4 Взаимодействие внеклеточной ДНК с
клетками 22
1.4.1 Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR) 23
1.4.1.1 Лиганды для белков TLR9. 25
1.5 TLR9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-cигнальные пути 27
1.6 Роль цитокинов в организме 36
1.6.1 Провоспалительные цитокины 37
1.6.2 Противовоспалительные цитокины 39
2 Материалы и методы 42
2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток 42
2.1.2 Исследование экспрессии клетками поверхностных белков 45
2.2 Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови 46
2.3 Конструирование плазмиды п(рДНК) 48
2.4 Выделение РНК из мезенхимальных стволовых клеток 49
2.4.1 Обработка выделенной РНК ДНКазой 50
2.4.2 Определение концентрации РНК 50
2.5 Выделение ДНК из мезенхимальных стволовых клеток 50
2.5.1 Определение концентрации ДНК 51
2.6 Постановка полимеразцой цепной реакции .
2.6.1 Проведение реакции обратной транскрипции 51 2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени 52
2.7 Иммуногистохимия 54
2.7.1 Связывание антител с NF-kB 54
2.7.2 Связывание антител с TLR9 2.8 Иммуноферментный анализ секреции цитокинов 55
2.8.1 Иммуноферментный анализ секреции цитокина IL-10 55
2.8.2 Иммуноферментный анализ секреции цитокина TNF 58
2.9 Определение активности каспазы 3 61
2.10 Статистическая обработка результатов 61
3 Результаты и обсуждения 62
3.1 Рецепторы, отвечающие на действие CG-богатой внеклеточной ДНК 62
3.1.1 Определение экспрессии мРНК TLR9 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК Е.coli 66
3.2 Исследование сигнальных путей, активирующихся в мезенхимальных стволовых клетках в ответ на действие фрагментов п(рДНК) 73
3.2.1 Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути – MyD88 в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК). 73
3.2.2 Aктивация NF-kB -, JNK/p38-, IRF- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК) 76
3.2.3 Транслокация NF-kB в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК)
3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов
IL10 и TNF
3.3 Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК 89
Обсуждение результатов 90
Выводы 94
4 список литературы
