Введение
Обзор литературы 9
1. Проблема концевой недорепликации, структура и функции теломер
2. Фермент теломераза, и ее функция в клетке
3. Иммортализация при помощи активации теломеразы.
4. Стволовые клетки в организме человека
Материалы и методы 43
1. Культуры клеток 43
1.1 Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, культура XI .
1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культура BMSCS.
1.3 Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, культура LA.
1.4 Фетальные нейральные стволовые клетки человека, культура NSC
1.5 Клетки линии ТК-164
2. Введение гена каталитического компонента теломеразы при помощи лентивирусного вектора 46
3. Дифференцировка клеток и методы регистрации 47
3.1 Дифференцировка в адипогенном направлении и специфическое окрашивание.
3.2 Дифференциовка в остеогенном направлении и специфическое окрашивание.
3.3 Иммуноцитохимия.
3.4 Выявление белкового компонента теломеразы in situ
3.5 Доверительные интервалы (погрешности)
4. Изучение кариотипа 51
4.1 Приготовление хромосомных препаратов из митотических клеток человека
4.2 Дифференциальное R-окрашивание хромосом.
5. Определение экспрессии генов методом ОТ-ПЦР 52
5.1 Выделение РНК
5.2 Реакция обратной транскрипции и ПЦР.
5.3 Использованные в работе праймеры
6. Определение теломеразной активности 56
6.1 Приготовление клеточного экстракта
6.2 Реакция TRAP и PAG-электрофорез
7. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) теломерного повтора на хромосомах человека 59
8. Тест на наличие контактного торможения пролиферации и реакции на сывороточное голодание 59
Результаты 61
1. Введение гена hTERT в мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека,
полученные из различных типов тканей и исследование их дифференцировочного потенциала 61
1.1 Стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI и Xl-lenti-hTERT
1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культуры BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT.
1.3 Стромальные клетки жировой ткани человека, культуры LA и LA-lenti-hTERT
1.4 Тест на наличие контактного торможения и реакцию на сывороточное голодание, клеток BMSCS-lenti-hTERT.
2. Введение гена hTERT в нейральные стволовые клетки человека (НСК) и исследование свойств полученной линии.. 69
2.1 Клетки NSC и NSC-lenti-hTERT.
2.2 Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров дифференцировки.
2.3 Определение экспрессии маркеров дифференцировки методом ОТ-ПЦР.
2.4 Нейросферы, полученные из NSC и NSC-lenti-hTERT
2.5 Образование колоний разной морфологии.
2.6 Кариотипирование культуры NSC-lenti-hTERT.
2.7 Определение теломеразной активности методом TRAP.
2.8 Качественный анализ величины теломер клеток NSC4-lenti-hTERT.
2.9 Определение теломеразной активности иммуногистохимическим методом.
Обсуждение результатов 83
1. Образование иммортализованных культур стволовых клеток in vitro при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы человека...85
2. Сохранение механизмов дифференцировки в иммортализованных культурах клеток 88
3. Сохранение теломеразной активности 91
4. Стабильность кариотипа, сохранение способностей к контактному торможению и сохранение способности к переходу в пролиферативный покой в условиях сывороточного голодания 92
Выводы 95
Благодарности 96
Список литературы 97
