Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1.1. Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих 15
1.2. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний типа А. 18
1.3. Факторы, стимулирующие пролиферацию и дифференцировку 21 сперматогоний
1.4. Сперматогенез у различных видов млекопитающих 23
1.5. Выделение стволовых клеток сперматогоний млекопитающих 28 и культивирование in vitro
1.6. Трансплантация СКС 32
1.7. Заключение 34
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1. Подготовка животных 36
2.2. Приборы и оборудование 36
2.3. Культуральные среды, растворы и реактивы 39
2.3.1. Ростовые среды 39
2.3.2. Специальные среды и растворы 39
2.4. Культуральная посуда 41
2.5. Приготовление фидерных слоев для культивирования СКС 42
2.5.1. Культивирование STO-фибробластов и перевиваемых 42 клеток Сертоли свиней
2.5.2. Получение первичных клеток Сертоли свиней и их 42 культивирование
2.5.3. Субкультивирование клеток 43
2.5.4. Подавление пролиферативной активности клеток 44 фидерных слоев
2.6. Выделение культур клеток из семенника самца свиньи 44
2.6.1. Механический метод выделения 44
2.6.2. Ферментативный метод выделения 44
2.6.3. Очистка стволовых клеток сперматогоний типа А от других клеточных типов семенника 45
2.7. Идентификация стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи in vitro
2.7.1. Идентификация СКС в образцах фиксированных тканей 45
2.7.2. Идентификация СКС в культуре 46
2.8. Введение молекул экзогенной ДНК в клетки Сертоли свиньи, STO-фибробласты и культуры клеток, выделенные из семенников самца свиньи46
2.8.1. Происхождение рекомбинантной конструкции, используемой в экспериментах 46
2.8.2. Приготовление ДНК 47
2.8.3. Введение экзогенной ДНК электрическим пробоем 47
2.8.4. Выявление продукта экспрессии (бета-галактозидазы) в трансфецированных клетках47
2.9. Трансплантация стволовых клеток сперматогоний типа А свиней в семенники стерильных реципиентов 48
2.9.1. Формирование экспериментальных групп животных 48
2.9.2. Выключение сперматогенеза у животных-реципиентов 48
2.9.3. Получение культур клеток из семенников донора 49
2.9.4. Введение клеток донора в семенники животных- реципиентов 49
2.9.5. Анализ эффективности возобновления сперматогенеза у реципиентов клетками донора
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 51
3.1. Изучение динамики сперматогенеза и характеристика клеточных типов семенника свиньи в образцах фиксированных тканей .
3.2. Влияние возраста хрячков на получение обогащенной культуры СКС. 55
3.2.1. Определение оптимального возраста хрячков для 56
получения обогащенной культуры СКС на основе анализа образцов фиксированных тканей.
3.3. Выделение СКС из семенников самцов свиней 57
3.3.1. Сравнительный анализ эффективности механического и ферментативного способов выделения культур клеток из семенников свиней57
3.3.2. Очистка СКС от других клеточных типов семенника. 61
3.4. Характеристика клеточных типов семенника в культуре 62
3.5. Культивирование СКС 64
3.5.1. Влияние различных монослоев соматических клеток на поддержание СКС в культуре.
3.5.2. Влияние ростовых факторов на культивирование СКС свиньи 68
3.6. Сравнительный анализ компетентности различных типов клеток к поглощению рекомбинантной ДНК
3.7. Обработка животных-реципиентов бусульфаном с целью 72 выключения их собственного сперматогенеза 64
3.7.1. Влияние кратности обработок бусульфаном на дегенерацию стволовых клеток сперматогоний типа А 73
3.7.2. Влияние обработок бусульфаном на физическое состояние животных-реципиентов
3.8. Введение донорских СКС типа А свиньи в семенники животных-реципиентов
3.9. Анализ эффективности трансплантации донорских клеток 77
3.10. Исследование динамики экзогенного сперматогенеза у животных-реципиентов
4. ОБСУЖДЕНИЕ 83
5. ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103
