Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
І.І.Молекулярногбиологическая и эпидемиологическая характеристика респираторных вирусов 12
l.l.l.PHK-содержащие вирусы 12
1.1.1.1. Семейство Orthomyxoviridae 12
1.1.1.2. Семейство Paramyxoviridae 18
1.1.1.3. Семейство Picornaviridae 22
1.1.1.4. Семейство Coronaviridae 25
1.1.2. ДНК-содержащие вирусы 27
1.1.2.1. Семейство Adenoviridae 27
1.1.2.2. Семейство Herpesviridae 30
1.1.2.3. Бокавирус человека 30
1.2. Методы этиологической диагностики респираторных заболеваний 32
1.2.1. Выделение вируса в культуре чувствительных клеток 33
1.2.2. Иммунологические методы выявления респираторных вирусов 35
1.2.2.1. Реакции с использованием химических меток 36
1.2.2.2. Реакции, основанные на феномене агглютинации эритроцитов 39
1.2.2.3. Методы серологической диагностики 40
1.2.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот 41
1.2.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 42
1.2.3.2. Мультиплексная ПЦР 44
1.2.3.3. ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 45
1.2.3.4. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 47
1.2.3.5. Другие методы амплификации нуклеиновых кислот 47
1.2.3.6. Тип образца и методы пробоподготовки 50
1.2.3.7. Выявление ингибиторов амплификации и контроль контаминации 51
1.2.3.8. Клиническое применение методов амплификации нуклеиновых кислот 54
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Лабораторные штаммы вирусов 57
2.1.2. Клеточные линии 57
2.1.3. Клинические образцы 59
2.1.4. Реактивы 60
2.2. Методы 60
2.2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 60
2.2.2. Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР 60
2.2.3. Выделение вирусных нуклеиновых кислот 61
2.2.4. Реакция обратной транскрипции 61
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (моноспецифический формат) 61
2.2.6. Полимеразная цепная реакция (мультиплексный формат) 62
2.2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле 62
2.2.8. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в
режиме реального времени (TaqMan) 62
2.2.9. Получение калибратора для количественного учета вирусной РНК в
биологических образцах 63
2.2.10.Статистическая обработка результатов исследований 63
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 65
3.1. Подбор праймеров и оптимизация условий выявления ДНК аденовирусов человека в биологических образцах методом ПЦР 65
3.2. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий для дифференциального выявления риновирусов и энтеровирусов в биологических образцах методом ПЦР 70
3.3. Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле 78
3.4. Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления 10 групп респираторных вирусов в биологических образцах 83
3.4.1. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий мультиплексной ПЦР-РВ 83
3.4.2. Сравнительный анализ эффективности и чувствительности мультиплексной и моноспецифической ПЦР-РВ 92
3.4.3. Испытание тест-системы на клинических образцах, полученных от больных с симптомами ОРВИ 94
3.5. Количественное определение нуклеиновых кислот респираторных вирусов 102
Заключение 105
Выводы
