Введение
1. Принципы селективности в методах выявления точечных мутаций в НК (обзор литературы) 8
1.1. Детекция известных мутаций 8
1.1.1. Рестрикционный анализ 8
1.1.2. Аллель специфичная гибридизация 9
1.1.3. Методы выявления мисматчей в дуплексе олигонуклеотид/ДНК 13
1.1.3.1. Химическая реакция 13
1.1.3.2. ДНКзимы 14
1.1.3.3. Flap-эндонуклеазы 15
1.1.3.4. Методы лигирования 15
1.1.3.5. Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз 19
1.2 Детекция новых мутаций 22
1.2.1. Конформационный анализ
1.2.1 Л. Конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК 22
1.2.1.2. Полиморфизм длин фрагментов при действии эндонуклеазой Cleavase I 22
1.2.2. Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК 23
1.2.2.1 Физико-химические методы 23
1.2.2.2. Методы химического расщепления гетеродуплексов 24
1.2.2.3. Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков 25
1.3 Методы секвенирования 28
1.3.1. Секвенирование при синтезе 28
1.3.1.1. Секвенирование по Сэнгеру 28
1.3.1.2. Секвенирование при полимеризации 31
1.3.2. Секвенирование при расщеплении 36
1.3.2.1. Химическое расщепление 36
1.3.2.2. Экзонуклеазное расщепление 36
1.4. Заключение 38
2. Экспериментальная часть 39
2.1. Исходные материалы 39
2.1.1. Реактивы и препараты 39
2.1.2. Буферы и растворы 39
2.1.3. Праймеры 40
2.2. Основные методы 40
2.2.1 Синтез и выделение олигонуклеотидов 40
2.2.2. Получение и выделение ПЦР-фрагментов 41
2.2.3. Метод лигирования олигонуклеотидов 42
2.2.4. УФ-иммобилизация и колориметрическое выявление на капроне 43
2.2.5 Исследование термической денатурации 44
2.2.6. Расчет термодинамических параметров комплексообразования 44
3. Выявления точечных мутаций в днк методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования (результаты и обсуждение) 46
3.1. Разработка подхода к выявлению точечных мутаций 46
3.1.1. Концепция метода 46
3.1.2. Оптимизация условий анализа 49
3.1.2.1. Подбор концентрационных условий 49
3.1.2.2. Влияние дозы УФ-облучения на эффективность выявления ДНК 51
3.1.2.3. Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов на различных ДНК-матрицах 52
3.1.2.4. Влияние длины ПЦР-фрагмента на эффективность его колориметрического выявления 60
3.1.3. Колориметрическое выявление точечных мутаций 62
3.1.3.1. Детекция тринуклеотидной делеции и вставки (модель CFTR) 62
3.1.3.2. Детекция однонуклеотидных замен (модель ВИЧ-1) 63
3.2.Селективность гибридизации 65
3.2.1. Описание модели 65
3.2.2. Анализ функции селективности 66
3.2.3. Изменение селективности при варьировании концентрации зонда 71
3.2.4. Изменение селективности при варьировании структуры зонда 73
3.2.5. Изменение селективности при выявлении различных мисматчеи 77
3.2.6. Анализ полученных результатов 81 33. Селективность лигирования 86
3.3.1. Дизайн модельной системы $6
3.3.2. Термическая стабильность модельных дуплексов 87
3.3.3. Лигирование комплементарных комплексов 90
3.3.4. Дискриминация одиночных мисматчеи вблизи одноцепочечного разрыва 93
3.4. Программа для выбора максимально селективных зондов 98
Выводы 103
Список литературы 104
Приложение 114
