Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1. Общие свойства апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека 9
1.2. Синтез АРЕ1 в клетке. АРЕ1 как окислительно-восстановительный фактор (Ref-І) 10
1.3. Участие АРЕ1 в эксцизионной репарации оснований ДНК
1.3.1. Этапы эксцизионной репарации оснований 14
1.3.2. З -фосфатазная ц З -фосфодиэстеразная активности 16
1.3.3. Взаимодействие АРЕ1 с белками ЭРО 18
1.3.4. ДНК-связывающая, эндонуклеазная и экзонуклеазная активности
АРЕ1. Особенности механизма эндонуклеазпой реакции АРЕ1 22
1.4. 3-5 -экзонуклеазная активность АРЕ1 28
1.4.1. Удаление неспаренных и модифицированных нуклеотидов с 3 -конца 28
1.4.2. Влияние типа ДНК-дуплекса на экзонуклеазную активность АРЕ1 29
1.4.3. Экзонуклеазная активность АРЕ 1 в зависимости от структурных особенностей 5 -конца олигонуклеотида 30
1.4.4. Влияние условий реакции на экзонуклеазную и эндонуклеазную
активности АРЕ1 31
1.5. Инцизионная репарация нуклеотидов ДНК 33
1.6. Участие АРЕ1 в апоптозе и других процессах 35
1.7. Роль АРЕ1 в развитии заболеваний 1.7.1. Уровень АРЕ1 при различных заболеваниях 37
1.7.2. Терапия 40
Заключение к главе 1 42
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 43
2-1; Материалы 43
2.1.1. Реактивы 43
2.1.2. Ферменты, антитела, бактериальный штамм, плазмидная ДНК и клеточный экстракт 43
2.1.3. Нуклеотиды, радиоактивномеченые соединения и оли?опуклеотиды 44
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Гель-электрофорез в ПААГ нуклеиновых кислот и белков 46
2.2.2. Выделение и очистка рекомбинантной апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, экспрессированной в клетках E.coli
2.2.3. Включение [32Р]-метки в 5 -конец олигонуклеотида, очистка олигонуклеотидов и формирование ДНК-дуплексов 49
2.2.4. Создание ДНК-структур, содержащих ddNMP, морфолидаты или фотоактивируемые аналоги dCMP ((У) на 3 -конце праймера 51
2.2.5. Лигирование одноцепочечного разрыва с фотоактивным аналогом dNMP на 5-конце 52
2.2.6. Встраивание в З -конец одноцепочечного разрыва природного dNMP после фотоаналога с помощью (5-полимеразы 52
2.2.7. Синтез ДНК, катализируемый Р-полгшеразой на ДНК-гес 52
2.2.8. Эндонуклеазная активность АРЕ1 52
2.2.9. Экзонуклеазная активность АРЕ1 53
2.2.10. Экзонуклеазная активность АРЕ! в обращенных мицеллах 53
2.2.11. Реакция фотоаффинной модификации 54
2.2.12. Определение концентрации АР El и Р-полимеразы в MEF-экстракте с помощью иммуноблоттинга 55
2.2.13. Определение стабильности комплексов ДНК-дуплексов с АРЕ1, р-полимеразой и/или RPA методом задержки в геле 56
2.2.14. Определение стабильности ДНК-дуплексов методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала 56
2.2.15. Трипсинолиз АРЕ1 57
2.2.16. Флуоресцентный анализ термической денатурации АРЕ 1 57
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59
3.1. Выделение и очистка АРЕ1 59
3.2. 3 —5 -экзонуклеазная активность АРЕ1 60
3.2.1. Экзонуклеазное выщепление природных нуклеотидов 61
3.2.2. Фотоактивируемые аналоги как модели природных dNMP в составе канонической или неканонической пары 64
3.2.3. Выщепление с 3 -конца праймера аналогов dNMP, модифицированных по рибозе 68
3.2.4. Зависимость 3 —5 -экзонуклеазной активности АРЕ1 от типа ДНК-дуплекса и структурных особенностей 5 -конца олигонуклеотида, фланкирующего одноцепочечный разрыв 71
3.2.5. Влияние условий реакции на эндонуклеазную и 3 -5 -экзонуклеазную активности АРЕ1 77
3.2.6. 3 —5 -экзонуклеазная активность АРЕ1 и стабильность ДНК-дуплекса 91
3.3. Взаимодействие АРЕ1 с ДНК и другими белками 100
3.3.1. Фотоаффинная модификация рекомбинантных белков АРЕ1 и Р-полимеразы 101
3.3.2. Фотоаффииная модификация АРЕ 1 и/3-полимеразы при совместном присутствии очищенных белков и в клеточном экстракте 104
3.3.3. Связывание АРЕ 1 с различными олигонуклеотидными структурами 107
3.3.4. Взаимодействие АРЕ 1 с Р-полимеразой, RPA uXRCCl 111
Заключение к главе 3 117
Выводы 123
Список литературы
