Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Свертывание крови 10
1.2 Тромбоциты и их субпопуляции 12
1.3 Мембранно-зависимые реакции в свертывании крови
1.3.1 Комплекс протромбиназы и внутренней теназы 22
1.3.2 Механизмы мембранно-зависимых реакций 25
1.4 Взаимодействие факторов свертывания с субпопуляциями активированных тромбоцитов 27
1.4.1 Витамин К-зависимые факторы ( VII(a), IX(a), X(a), a также протромбин, протеины С, S и Z) 27
1.4.2 Кофакторы Va и VIIIa 29
1.4.3 Тканевый фактор и тромбомодулин 30
1.4.4 Факторы, взаимодействующие с тромбоцитами и микровезикулами через рецепторы 31
Постановка задачи 32
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1 Материалы 33
2.2 Пациенты 35
2.3 Методы
2.3.1 Выделение тромбоцитов из цельной крови 36
2.3.2 Конъюгирование факторов свертывания с флуоресцентной меткой 36
2.3.3 Подготовка искусственных фосфолипидных везикул 37
2.3.4 Равновесное связывание факторов Х и Ха с активированными тромбоцитами и искусственными фосфолипидными везикулами 38
2.3.5 Исследование кинетики взаимодействия факторов Х и Ха с активированными тромбоцитами и искусственными фосфолипидными везикулами 39 2.3.6 Исследование взаимодействия фактора Ха с тромбоцитарным тромбом в условиях потока 40
2.3.7 Исследование взаимодействия фактора Х с фосфолипидными мембранами методом плазмонного резонанса 41
2.3.8 Визуализация олигомеров фактора Х и Аннексина V 41
2.3.9 Равновесное связывание фактора XII тромбоцитами
2.3.10 Микроскопическое исследование распределения кофакторов V и VIII на мембране активированных тромбоцитов 42
2.3.11 Микроскопическое исследование распределения факторов IXa, Ха, X, протромбина, а также аннексина V на мембране активированных тромбоцитов
2.3.12 Измерение скорости активации фактора Х комплексом внутренней теназы 44
2.3.13 Исследование ультраструктуры тромбоцитов методом трансимссионная электронная микроскопия
2.3.14 Исследование ультраструктуры тромбоцитов методом сканирующей электронной микроскопии с фокусированным ионным пучком 45
2.3.15 Исследование распределения аннексина V и факторов свертывания в тромбоцитарном тромбе 45
2.3.16 Статистическая обработка 46
Глава 3. Результаты 47
3.1 Механизмы взаимодействия факторов свертывания Х и Ха с
фосфолипидными мембранами 47
3.1.1 Взаимодействие факторов Х и Ха с мембраной активированных тромбоцитов с учетом их деления на субпопуляции 47
3.1.2 Кинетические характеристики связывания факторов Х и Ха с мембраной фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов 50
3.1.3 Взаимодействие факторов Х и Ха с фосфолипидными везикулами 54
3.1.4 Взаимодействие факторов Х и Ха с активированными тромбоцитами у пациентов с синдромом серых тромбоцитов 54
3.1.5 Исследование взаимодействия фактора Х с фосфолипидной мембраной методом поверхностного плазмонного резонанса 56
3.1.6 Влияние различных условий на взаимодействие факторов Х и Ха с фосфолипидной мембраной 57
3.1.7 Сравнение кинетики взаимодействия ФХ и ФХа с фосфолипидными везикулами при различных концентрациях факторов 59
3.1.8 Возможность гетероолигомеризации факторов Х и Ха 60
3.1.9 Взаимодействие факторов Х и Ха с тромбоцитарным тромбом 61
3.1.10 Визуализация олигомеров фактора Х и Аннексина V
3.2 Взаимодействие фактора XII с активированными тромбоцитами. 64
3.3 Распределение факторов на мембране активированных тромбоцитов
3.3.1 Распределение Аннексина V 67
3.3.2 Распределение факторов 69
3.3.3 Распределение кофакторов 71
3.3.4 Распределение факторов у пациентов с синдромом серых тромбоцитов 73
3.3.5 Влияние концентрирования факторов на ускорение мембранных реакций 74
3.3.6 Изменение морфологии тромбоцитов при активации 75
3.3.7 Ультраструктура активированных тромбоцитов 76
3.3.8 Распределение аннексина V и факторов свертывания в тромбоцитарном тромбе 79
Глава 4. Обсуждение 81
Заключение 85
Выводы 86
Список сокращений и обозначений 87
