Введение
1. Сывороточный альбумин: взаимодействие с лигандами и каталитические свойства 10
1.1. Структура и взаимодействие сывороточного альбумина с лигандами 10
1.2. Каталитические свойства сывороточного альбумина 14
1.2.1. Сывороточный альбумин как гидролаза 14
1.2.1.1. Гидролиз сложных эфиров 14
1.2.1.2. Гидролиз тиоэфиров 24
1.2.1.3. Гидролиз производных фосфорной и фосфоновой кислот 25
1.2.1.4. Гидролиз амидов и амидофосфатов 28
1.2.1.5. Гидролиз Р-лактамных антибиотиков 30
1.2.1.6. Гидролиз бензизоксазола 31
1.2.2. Сывороточный альбумин как лиаза 32
1.2.3. Сывороточный альбумин как изомераза 34
1.2.3.1. Кето-енольная таутомерия и структурная изомеризация эпоксисоединений 34
1.2.3.2. Перемещение двойной связи 36
1.2.4. Сывороточный альбумин как оксидоредуктаза 37
1.2.5. Роль лизина в реакциях, катализируемых сывороточным альбумином 39
1.3. Заключение 42
2. Экспериментальная часть 43
2.1. Материалы и методы 43
2.2. Адсорбция полирибонуклеотида на носителе 47
2.3. Разделение суммарного белка плазмы крови на аффинных сорбентах 48
2.4. Иммуноферментный анализ белков 48
2.5. Очистка альбумина 49
2.6. Получение гликированного и TV-гомоцистеинилирован-ного альбумина 50
2.7. Сравнительный анализ связывания нативного, гликированного и iV-гомоцистеинилированного альбумина с поли(А) 50
2.8. Флуоресцентное титрование гликированного альбумина растворами полирибонуклеотидов 51
2.9. Определение РНК-гидролизующей активности альбумина in situ 51
2.10. Введение Р-метки по 5-концевой фосфатной группе олигонуклеотидов и транскрипта РНК HIV-1 52
2.11. Определение активности человеческого сывороточного альбумина в реакции гидролиза олигодезокси- и олигорибонуклеотидов 53
2.12. Аффинная модификация альбумина фосфорилирующим производным р(Ц)б 55
2.13. Ферментативный гидролиз продуктов аффинной модификации альбумина 56
3. Взаимодействие нативного и химически модифицированных сывороточных альбуминов - аналогов клинически значимых форм белка человека - с олиго- и полирибонуклеотидами 57
3.1. Сывороточный альбумин как один из основных полирибонуклеотид- связывающих белков плазмы крови человека 57
3.1.1. Аффинная сорбция белков плазмы крови на полинуклеотид-содержащих сорбентах 58
3.1.2. Анализ белков, полученных аффинной сорбцией на полинуклеотид-содержащих сорбентах 61
3.2. Влияние клинически значимых химических модификаций альбумина на связывание белком гомополирибонуклеотидов 65
3.2.1. Получение in vitro химически модифицированных сывороточных альбуминов - аналогов клинически значимых форм белка человека 65
3.2.1.1. Получение гликированного альбумина и его характеризация 65
3.2.1.2. Получение iV-гомоцистеинилированного альбумина и его характеризация 71
3.2.1.3. Влияние модификации альбумина на его вторичную структуру 72
3.2.2. Влияние гликирования и iV-гомоцистеинилирования на эффективность связывания альбумином поли(А) 73
3.2.3. Взаимодействие гликированного альбумина с гомополинуклеотидами 75
3.3. РНК-гидролизующая активность сывороточного альбумина 77
3.3.1. Некоторые механизмы гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК 78
3.3.2. Анализ гомогенности используемого в работе препарата альбумина 80
3.3.3. Тестирование альбумина на РНК-гидролизующую активность 81
3.3.4. Определение кинетических параметров реакции расщепления фосфодиэфирных связей в РНК в присутствии альбумина 85
3.3.5. Субстратная специфичность альбумина в реакции расщепления фосфодиэфирных связей в РНК 88
3.3.6. Зависимость эффективности расщепления фосфодиэфирных связей в РНК в присутствии альбумина от рН 99
3.3.7. Исследование влияния ионов металлов, связанных с человеческим сывороточным альбумином, на его РНК-гидролизующую активность 101
3.4. Влияние гликирования и JV-гомоцистеинилирования на РНК-гидролизующую активность альбумина 103
3.5. Установление сайта связывания альбумина с олигорибонуклеотидами 105
3.5.1. Аффинная модификация альбумина фосфорилирующим аналогом P(U)6 105
3.5.2. Анализ модифицированных пептидов методами гель-электрофореза и MALDI-TOF масс-спектрометрии 110
Приложения 112
Выводы 114
