Введение
2. Литературный обзор 8
2.1. Углеводородные загрязнения окружающей среды 8
2.1.1. Состав углеводородных загрязнителей: нефти, мазута, нефтешламов 9
2.1.2. Восстановление почв, загрязненных углеводородами 12
2.1.2.1. Методы восстановления природных объектов при нефтяных загрязнениях 12
2.1.2.2. Биологическая очистка почв 14
2.2. Свойства и применение бактерий рода Rhodococcus в биоремедиации 18
2.2.1 .Общая характеристика микроорганизмов рода Rhodococcus 18
2.3. ПАУ-разлагающие микроорганизмы 19
2.4. Механизмы биодеградации углеводородов 24
2.4.1. Механизмы биодеградации алифатических углеводородов 25
2.4.2. Механизмы расщепления ароматических УВ 28
2.4.. Расщепление ароматической структуры 28 2.4.2.2 Механизмы биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) 33
2.5. Идентификация микроорганизмов в почве 41 2.5.1. Иммунохимические методы идентификации микроорганизмов с акцентом на родококки 42
2.5.1.1. Реакция иммуноагглютинации 42
2.5.1.2. Иммунодиффузия 43
2.5.1.3. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) 45
2.5.1.4. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 45
2.5.1.5. Иммуноферментный анализ (ИФА) 46
3. Материалы и методы 49
3.1. Объекты исследования 49
3.1.1. Оптимизация состава питательных сред для масштабированного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер» 50
3.1.2. Полевые испытания препарата «Родер» (сухой формы) для биоремедиации почв, загрязненных углеводородами 51
3.2. Условия проведения лабораторных экспериментов 53
3.2.1. Адаптация штаммов к исследуемому субстрату 53
3.2.2. Изучение закономерности потребления смеси парафинов и дизельного топлива в качестве единственного источника углерода 54
3.2.3. Проведение скрининга культур микроорганизмов 54
3.2.4. Выделение чистых культур 55
3.2.5. Изучение способности клеток сорбировать ПАУ 55
3.2.6. Изучение закономерности потребления ПАУ в качестве единственного источника углерода и в присутствии косубстрата 55
3.2.7. Изучение закономерности потребления алифатических углеводородов культурой Pseudomonas sp. 56
3.2.8. Испытания разработанного ммунохимического анализа штаммов R. ruber и R, erytropolis 56
3.3. Методы 56
3.3.1. Гравиметрический анализ почвенных проб 56
3.3.2. Определение содержания летучих жирных кислот (ЛЖК) 59
3.3.3. Определение содержания алканов 59
3.3.4. Определение концентрации ПАУ 60
3.3.5. Определение концентрации растворимого белка 61
3.3.6. Определение СОг в газовой фазе 62
3.3.6. Проведение окраски по методу Грама 62
3.3.7. Расчет кинетических параметров биодеградации углеводородов 63
3.3.8. Определение численности микроорганизмов классическим микробиологическим методом 64
3.3.9. Определение клеток R. ruber и R erythropolis методом ИФА 64
3.3.9.1. Получение антисывороток против R, ruber и R. erythropolis 65
3.3.9.2. Сорбция клеток на планшете 65
3.3.9.3. Тестирование антисывороток 66
3.3.9.4. Построение калибровочной кривой 66
3.3.10. Выделение ДНК 68
3.3.11. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК 68
3.3.12. Детектирование продуктов ПЦР 69
3.3.13. Очистка ПЦР-фрагментов 69
3.3.14. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей 69
4. Результаты и обсуждение 70
4.1. Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер» 70
4.2. Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов 71
4.2.1. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной застарелым мазутом
(Обуховский завод, участки №1 и №2) 71
4.2.2. Биоремедиация препаратом «Родер» железнодорожного шлама 78
4.2.3. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной нефтью 82
4.2.4. Сравнительный анализ результатов деградации углеводородных загрязнений
препаратом «Родер» 86
4.3. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов
штаммами R, ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D) 87
4.3.1. Кинетические закономерности биодеградации жидких парафинов адаптированными штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D) 87
4.3.2. Кинетические закономерности биодеградации углеводородов дизельного топлива адаптированными штаммами R. ruber (Ас-1513-D) и R. erythropolis (Ас-1514-D) 90
4.4. Изучение биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) 94
4.4.1.Изучение биодеградации ПАУ штаммами R. ruber и R. erythropolis 94
4.4.2. Скрининг эффективных биодеструкторов ПАУ 95
4.4.3. Выделение чистой культуры из накопительной культуры 2ПЗ и ее идентификация 97
4.4.4. Кинетические свойства культуры Pseudomonas aeruginosa при росте на различных углеводородах 100
4.5. Исследование влияния P. aeruginosa на рост R. ruber и R. erythropolis 105
4.6. Совместное потребление ПАУ и гексадекана консорциумом трех штаммов 105
4.7. Определение концентрации клеток родококков методом ИФА 108
5. Выводы 114
6. Список литературы 115
