Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Саркотоксин IA 7
1.1.1. Саркотоксин IА - представитель семейства цекропинов 7
1.1.2. Структура и физические свойства пептида 8
1.1.3. Биологическая роль и механизм действия пептида 11
1.1.4. Синтез и выделение пептида 14
1.2. Гибридные белки 16
1.2.1. Структура гибридного белка 16
1.2.2. Регуляция уровня экспрессии рекомбинантного белка в клетках Escherichia col і 26
1.3. Зеленый флуоресцентный белок 46
1.3.1. Структура белка и образование хромофора 46
1.3.2. Мутантные варианты GFP и их спектрофотометрические свойства 48
1.3.3. Физико-химические свойства белка 53
1.3.4. Экспрессия GFP 56
1.3.5. Выделение GFP 59
Глава 2. Материалы и методы 61
2.1. Материалы 61
2.2. Методы исследования 61
2.2.1. Создание генно-инженерных конструкций 61
2.2.2. Продукция гибридных белков в клетках Е. coli 66
2.2.3. Выделение, ренатурация и очистка гибридных белков 66
2.2.4. Определение функциопалыюй активности и количества продукта 69
2.2.5. Ограниченный протеолиз 71
2.2.6. Иммуноблотинг 71
2.2.7. Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ пептидов 72
2.2.8. Синтез гибридного белка Sarc-Ob in vitro 72
Глава 3. Результаты и обсуждение 73
3. 1. Влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro 73
3. 1.1, Изучение процесса протеолнтической деградации GFP-Ob in vitro 73
3. 1.2. Изучение процесса протеолнтической деградации GFP-Ob in vivo 78
3.2. Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида 81
3.2.1. Глутатион-Б-трансфераза - саркотоксин 82
3.2.2. Саркотоксин - обелин 83
3.2.3. Зеленый флуоресцентный белок - саркотоксин 84
3.3. Разработка метода вьщеления низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP 84
3.3. 1. Создание и синтез гибридных белков в клетках Е. coli 85
3.3.2. Выделение EGFP-PDEy 87
3.3.3. Выделение EGFP-Sarc, EGFP-Th и BCCP-EGFP 88
3.4. Биосинтез и выделение рекомбинантного саркотоксина IA из клеток Е. coli 93
3.4.1. Синтез рекомбинантного саркотоксина in vitro 93
3.4.2. Очистка и характеристика рекомбинантного саркотоксина 95
Заключение 99
Выводы 100
Список литературы 101
