Введение
Обзор литературы «везикулярный транспорт в клетках эукариот» 11
1. Организация путей секреции в клетках дрожжей 11
2. Транспортные везикулы 13
2.1 СОРИ везикулы 13
2.1.1 Структура комплекса СОРИ 13
2.1.2 Сортировка белков в СОРИ везикулы 14
2.2 COPI везикулы 17
2.2.1 Структура комплекса COPI 17
2.2.2 Участие COPI везикул в прямом транспорте между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 20
2.2.3 Участие COPI везикул в обратном транспорте между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 22
2.2.2.1 Транспорт белков, содержащих дилизин овый сигнал 22
2.2.2.2 Транспорт белков, содержащих сигнал K/HDEL и белка Secl2p 25
2.2.3 Модели СОРГзависимого транспорта между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 26
2.3 Клатриновые везикулы 28
3. Транспорт между цистернами аппарата Гольджи 29
3.1 Структура аппарата Гольджи 29
3.2 Модели транспорта белков между цистернами аппарата Гольджи 31
4. Слияние мембран 35
4.1 Молекулы SNARE 36
4.2 Регуляция сборки комплекса SNARE 39
4.2.1 SM-белки - семейство белков Sccl/Muncl8 39
4.2.2 Белок SeclSp 40
4.3 Система связывающих белков 41
5 Роль ионов кальцияв секреторных путях 44
5.1 Кальциевые помпы 45
5.2.1 Кальциевые помпы дрожжей 46
5.3 Ответ клетки на снижение Са2+ в секреторных путях 47
Заключение 49
Материалы и методы 51
1. Плазмиды и штаммы микроорганизмов 51
1.1 Плазмиды, использованные в работе 51
1.1.1 Плазмиды, полученные в данной работе 51
1.2 Штаммы микроорганизмов 52
1.2.1 Штаммы дрожжей 52
1.2.2 Штаммы бактерий 58
2. Условия культивирования и генетические методы 58
3. Генно-инженерные манипуляции и полимсразиая цепная реакция 59
4. Выделение и анализ ДНК клеток Н. polymorpha 60
5. Выделение и анализ РНК клеток Н, polymorpha 61
6. Анализ секреторных белков дрожжей 61
6.1 Анализ белка Gaslp в клетках Н. polymorpha и S. cerevisiae 61
6.2 Получение антител и анализ белка Pmrlp в клетках Я polymorpha 62
6.3 Определение ферментативной активности и количества uPA 64
6.4 Зимография инвертазы 66
6.5 Анализ секретированной хитиназы 66
7. Иммупоблоттинг белков 66
8. Флуоресцентная микроскопия 67
Результаты 69
1. Клонирование и секвенировапие гена RET1 Н. poiymorpha 69
2. Делеция 3-концевой части кодирующей области гена HpRETl не летальна для клеток дрожжей 71
3. Ген HpRETl Н, poiymorpha является жизненно важным 75
4. Дефект сс-СОР приводит к секреции неправильно свёрнутых форм урокиназы 76
5. а-СОР Н. poiymorpha участвует в транспорте GPI-заякоренного белка Gaslp 80
6. Функциональное взаимодействие между а-СОР и Pmrlp Н. poiymorpha 82
6.1 Сверхэкспрессия HpPMRl супрессирует фен оптические проявления мутации ret 1-27 82
6.2 Мутация в гене HpRETl приводит к снижению количества белка Pmrlp и нарушению его распределения в клетках Н. poiymorpha 83
6.3 Мутация rctl-27 не приводит к нарушению гликозилирования секретируемых белков 84
6.4 Летальность сочетания мутации ret 1-27 с делецией гена HpPMRl 86
7. Идентификация генов Н. poiymorpha, в мультикопийном состоянии супрессируїощих мутаптные проявления retl-27 91
8. Изучение влияния сверхэкспрессии гена SES1 на фенотипические проявления мутаций retl-27 к Apmrl 93
9. Делеция гена HpSESl приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. poiymorpha 94
Обсуждение результатов 96
1. а-СОР дрожжей Н. poiymorpha: структурные особенности и роль в поддержании гомеостаза кальция 96
1.1 Мутации, затрагивающие С-концевую область белка а-СОР у S. cerevisiae и Н. polymorpha, приводят к различным фснотипическим проявлениям 97
1.2 Дефект а-СОР И. polymorpha приводит к нарушению обратного транспорта белков из Гольджи в эндоплазматический ретикулум 98
1.3 Функциональное взаимодействие белков Retlp и Pmrlp Я polymorpha 99
Заключение 109
Выводы 112
Список литературы 113
Благодарности 138
