Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Лекарственная устойчивость 10
1.2. Лекарственная устойчивость к препаратам класса нитрозомочевин 11
1.3. Механизмы лекарственной устойчивости меланомы 13
1.3.1. Белки-транспортеры семейства ABC, участвующие в развитии МЛУ меланомы 14
1.3.2. Меланосомы 16
1.3.3. Глутатион S-трансферазы в развитии резистентности меланомы 17
1.3.4. Повышенная активность протоновых помп 18
1.3.5. Активность антиапоптотических белков семейства Bcl-2 19
1.3.6. Активация ядерного фактора NFB 20
1.3.7. р53 и р63 21
1.3.8. Мутации NRAS/BRAF 22
1.3.9. Повышенная способность к репарации ДНК 23
1.4. Молекулярные механизмы преодоления лекарственной устойчивости
липосомальными противоопухолевыми препаратами 24
1.4.1. Липосомальный доксорубицин преодолевает МЛУ, связанную с
гиперэкспрессией ABC-транспортеров 26
1.4.2. Липосомальный цисплатин преодолевает резистентность 28
1.4.3. Липосомальные препараты из класса нитрозомочевин преодолевают
лекарственную устойчивость, связанную с отсутствием CD95-рецептора 30
1.5. Сигнальные пути клеточной гибели 31
1.6. Заключение 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Материалы и оборудование 38
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ-тест 42
2.2.2. Определение апоптоза методом двойного окрашивания аннексином V-FITC и пропидием йодидом 43
2.2.3. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 44
2.2.4. Подготовка клеточного материала и выделение общей РНК 45
2.2.5. Количественная полимеразно-цепная реакция в реальном времени и
определение уровня экспрессии мРНК рецепторов клеточной гибели
суперсемейства TNFSFR 46
2.2.6. Определение уровня экспрессии мРНК Beclin 1 с помощью ПЦР с обратной транскрипцией 47
2.2.7. Определение активных каспаз-3, -8 и -9 48
2.2.8. Оценка выброса родамина 123 на клеточных линиях меланом человека 48
2.3. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты исследований 50
3.1. Рецепторы внешнего пути апоптоза в клетках линий меланомы человека 50
3.1.1. Экспрессия мРНК рецепторов внешнего пути апоптоза в клетках линий меланомы человека, используемых в исследовании 50
3.1.2. Влияние аранозы-лио, липосомальной аранозы и пустых липосом на экспрессию мРНК рецепторов внешнего пути апоптоза 53
3.1.3. Заключение 56
3.2. Цитотоксическая активность и механизм клеточной гибели, индуцируемый противоопухолевыми препаратами из класса нитрозомочевин 57
3.2.1. Цитотоксическая активность и механизм клеточной гибели, индуцируемый аранозой-лио и липосомальной аранозой 58
3.2.2. Цитотоксическая активность и механизм клеточной гибели, индуцируемой ормустином-лио и липосомальным ормустином 64
3.2.3. Заключение 68
3.3. Влияние лекарственных форм препаратов класса нитрозомочевин на активацию каспаз 69
3.3.1. Активация каспаз -8 и -9 после инкубации клеток меланомы с липосомальной аранозой и аранозой-лио 69
3.3.2. Активация каспазы-3 после инкубации клеток меланомы с липосомальной аранозой и аранозой-лио 76
3.3.3. Активация каспаз -3, -8 и -9 после инкубации клеток меланомы с липосомальным ормустином и ормустином-лио 79
3.3.4. Заключение 84
3.4. Влияние липосомальной аранозы и аранозы-лио на индукцию аутофагии 85
3.5. Оценка изменения функциональной активности Р-гликопротеина по выбросу родамина 123 на клеточных линиях меланомы под влиянем лекарственных форм аранозы 3.5.1. Изучение влияния аранозы на развитие лекарственной устойчивости через усиление активности Р-гликопротеина 90
3.5.2. Оценка способности аранозы блокировать функцию Р-гликопротеина 92
3.5.3. Влияние лекарственных форм аранозы на функциональную активность Р гликопротеина 94
3.5.4. Заключение 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 99
Выводы 105
Список сокращений 106
Список литературы 107
