Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. как модельный объект молекулярно-генетических исследований
2.1.1. Основные характеристики Arabidopsis как модельного организма : 14
2.2. Первые мутанты A thaliana (L.) Heynh. 15
2.1.3. Геном A. thaliana. 16
2.2. Абиотический стресс. Холодоустойчивость. 17
2.3. Убиквитин-зависимый протеолиз. Введение 24
2.3.1. Биохимические механизмы и особенности убиквитин-зависимого протеолиза 24
2.3.2.1. Схема убиквитин-зависимого протеолиза 24
2.3.2.2. Протеосома 26S 25
2.3.2.3. Убиквитин 26
2.3.2.4. Этапы убиквитинилирования 29
2.3.2.5. Характеристика семейства F-бокс-содержащих генов и кодируемых ими белков 31 FBP
2.3.2.5.1. Классификация F-бокс-содержащих белков эукариот (FBP) на основании 32
данных об их структуре
2.3.2.5.2. F-домен 32
2.3.2.5.3. Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков млекопитающих 33
2.3.2.5.4. Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков A. thaliana 34
2.3.2.5.5. Функции эукариотических F-бокс белков FBP 35 2.3.2.5.5.1. Функции FBP у растений 36 2.3. Регуляция на уровне экспрессии генов: Транскрипционные факторы. Семейство bHLH. 39
2.4.1. Транскрипционные факторы эукариот 39
2.4.2. Транскрипционные факторы A. thaliana 41
2.4.3. Характеристика семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix-loop- 42 helix (bHLH)
2.4.3.1. История открытия и сравнительная характеристика семейства эукариотических транскрипционных факторов типа Basic helix-loop-helix (bHLH).
2.4.3.2. Структура домена basic helix-loop-helix (bHLH) 43
2.4.3.3. Классификация эукариотических белков семейства транскрипционных 45
факторов по типу basic helix-loop-helix (bHLH)
2.4.3.3.1. Классификация по типу основного домена 45
2.4.3.3.2. Классификации белков семейства транскрипционных факторов по типу bHLH 45 A. thaliana
2.4.3.4. Функции белков семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix- 47
loop-helix (bHLH)
2.4.3.4.1. Общие сведения 47
2.4.3.4.2. Функции белков bHLH 47
2.4.3.4.3. Функции белков bHLH A. thaliana 48
2.5. РНК-направленное «замолкание» генов - HDGS - феномен «подавления 48
экспрессии генов с высокой степенью идентичности»
2.5.1. Введение 48
2.5.2. Молекулярные механизмы 49
2.5.3. миРНК-биогенез 53
2.5.3.1. Регуляция активности генов посредством миРНК 53
2.5.3.2. Функционирование миРНК 54
2.5.3.3. миРНК-биогенез у растений 55
2.5.4. Особенности развития PTGS при системном транспорте у растений 56
2.5.5. Вирусные гены - супрессоры PTGS: HYR-зависимая РНК-полимераза RdRp 57
2.5.5.1. История открытия 5 7
2.5.5.2. Свойства РНК-зависимых РНК-полимераз у растений 59
2.5.6. Модель функционирования белковых комплексов, осуществляющих деградацию 59
мРНК с помощью киРНК
2.5.7. Использование метода получения индивидуального «замолкания» гена для молекулярно-генетических исследований
3. Материалы и методы 62
3.1. Линии растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 62
3.2. Штаммы бактерий и плазмиды 62
3.3. Питательные среды 63
3.4. Антибиотики и гербициды, использованные в качестве селективных агентов 64
3.6. Методы получения компетентных клеток Е. coli 65
3.6.1. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих эффективность трансформации 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.6.2. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих эффективность трансформации 106-107 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.6.3. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих эффективность трансформации до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.7. Методы трансформации клеток Е. coli 66
3.7.1. «Быстрая» трансформация клеток Е. coli с эффективностью 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.7.2 Трансформация клеток Е. coli с эффективностью 10-10 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.7.3 Трансформация клеток Е. coli с эффективностью до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК (электропорация).
3.7.4. Отбор клеток Е. coli, несущих рекомбинантные плазмиды. 67
3.8. Метод быстрого «переклонирования» ДНК из одного вектора в другой. 68
3.9. Скрининг бактериальных колоний методом ПЦР 68
3.10. Трансформация клеток бактерий Agrobacteriam tumefaciens 69
3.10.1 Конъюгативный перенос. 69
3.10.2. Трансформация клеток A. tumefaciens методом электропорации 69
3.11. Культивирование растений A. thaliana 70
3.11.1. Подготовка семян A. thaliana к посеву: поверхностная стерилизация. 70
3.11.2. Выращивание растений в стерильных условиях на чашках Петри 70
3.11.3. Выращивание растений в открытом грунте 71
3.11.4. Выращивание растений в стрессовых условиях 71
3.12. Агробактериальная трансформация растений A. thaliana 72
3.12.1. Агробактериальная трансформация на ранней стадии развития растения - 72
стадии прорастающих семян.
3.12.2. Агробактериальная трансформация неопыленных бутонов 73
3.13. Отбор трансгенных растений A. thaliana 1А
3.13.1. Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве (in vivo). 74
3.13.2. Отбор трансгенных растений A. thaliana в песке (in vivo). 74
3.13.3. Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro 75
3.14. Методы выделения геномной ДНК из тканей растений A. thaliana 75
3.14.1. Быстрое выделение ДНК из листьев A. thaliana для ПЦР-тестирования на наличие инсерции Т-ДНК.
3.14.2. Получение мини-препаратов ДНК из тканей растений A. thaliana 76
3.14.3. Выделение ДНК A. thaliana для блот-гибридизации 76
3.14.4. Выделение геномной ДНК A. thaliana для последующего клонирования 77
3.15. Методы выделения плазмидной ДНК из клеток бактерий 7 7
3.15.1. Получение мини-препаратов ДНК 7 7
3.15.2. Тепловой метод выделения ДНК 78
3.15.3. Получение препаратов плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей 79
3.15.4. Очистка препаратов ДНК от примесей белков 79
3.15.5. Очистка препаратов ДНК от примесей РНК 80
3.15.6. Хроматографическая очистка препаратов ДНК 80
3.15.7. Очистка препаратов ДНК методом электроэлюции 81
3.15.7.1. Трубчатый электрофорез 81
3.15.7.2. Электроэлюция в диализную плёнку 82
3.15.8. Очистка ДНК при помощи центрифугиро в ания 82
3.15.9 Концентрирование препаратов ДНК с помощью изо-бутанолового спирта 82
3.16. Метод амплификации ДНК для последующего клонирования 83
3.17. Клонирование фрагментов ДНК 8 3
3.18. Метод блот-гибридизации по Саузерну 84
3.19. Анализ мРНК в растительных тканях A. thaliana 85
3.19.1. Реакция обратной транскрипции с поли-Т праймером 85
3.19.2. Реакция обратной транскрипции с гексапраймерами. 85
3.20. Количественный ПЦР в реальном времени (qPCR) 86
3.21. Секвенирование ДНК 86
3.22. Праймеры, использованные в работе. 86
3.23. Определение углеводной и липидной составляющей в семенах трансгенных линий с помощью ЯМР.
4. Результаты и обсуждение. 89
4.1. Предпосылки. Инсерционная мутантная линия №137. 89 4.1.1. Локализация инсерции в гене Atlgl2860 трансгенной линии A. thaliana № 137. 89
4.2. Анализ экспрессии гена Atlgl2860 93
4.3. Поиск in silico генов с высокой степенью соответствия гену Atlgl2860 по нуклеотидному составу .
4.3.1. Сравнительный анализ генов со значимой степенью соответствия первой части гена Atlgl2860.
4.3.1.1. Анализ мутантного фенотипа мутантной линии A. thaliana, содержащей инсерцию в гене Atlgl3200.
4.3.2. Сравнительный анализ гена со значимой степенью соответствия второй части 102
гена Atlgl2860.
4.3. Получение трансгенных линий A.thaliana характеризующихся измененной 106
экспрессией гена Atlgl2860.
4.3.1. Создание векторных конструкций для получения трансгенных линий A.thaliana, 106
характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией первой и второй частей гена Atlgl2860 независимо.
4.3.1.1. ЭТАП 1. Амплификация нуклеотидных последовательностей двух частей гена 108 Atlgl2860.
4.3.1.2. ЭТАПЫ 2-4. Клонирование двух частей гена Atlgl2860 108
4.3.2. Создание векторной конструкции для получения трансгенных линий A.thaliana, 113
характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией полноразмерной копии
гена Atlgl2860.
4.3.2.1. Клонирование полноразмерной копии гена Atlgl2860 113
4
t
4.4. Вектор для РНК-направленного «замолкания» гена Atlgl2860. 118
4.4.1. Амплификация уникального фрагмента для РНК-направленного «замолкания» гена Atlgl 2860
4.4.2. Клонирование уникальных фрагментов со второго экзона гена Atlgl2860. 120
4.5. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana с помощью векторов, 124 специально созданных для определения тонкой структурно-функциональной организации и функции гена Atlgl2860.
4.6. Анализ мРНК гена Atlgl2860 в трансгенных линиях с измененной экспрессией 126 гена Atlgl2860.
4.6.1. Поиск альтернативных форм сплайсирования гена Atlgl2860. 128
4.6.2. Анализ in silico предполагаемой функции продукта гена At5g61270 132
4.8. Поиск мутантного фенотипа трансгенных линий A. thaliana, характеризующихся измененной экспрессией гена Atlgl2860.
4.8.1. Анализ развития трансгенных растений A. thaliana, характеризующихся 133
измененной экспрессией гена Atlgl2860, в стрессовых условиях.
4.10. Сравнение содержания липидов и углеводов в семенах трансгенных растений по 136
сравнению с растениями дикого типа.
5. Заключение 138
6. Выводы 142
7. Публикации. 143
7.1 Научные статьи 143
7.2 Тезисы конференций, устные и стендовые доклады. 144
7.3 Регистрация в базах данных. 145
8. Список литературы
