Введение
1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ АКТОМИОЗИН-ЗАВИСИМОЙ КЛЕТОЧНОЙ
ПОДВИЖНОСТИ И СОКРАТИМОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ 13
1.1 Актомиозшювый цитоскелет - механическая основа движения клеток 13
1.2. Актин и миозин II - главные сократительные белки клетки 13
1.3. ФосфорилированиеРЛЦ- ведущий механизм активации миозина 16
1.4. Ферменты, регулирующие уровень фосфорилирования миозина II 19
1.4.1. Киназа легких щпей миозина (КЛЦМ) 19
1.4.2. Rho-актжируемая киназа (Rho-киназа) 20
1.4.3. Другие Са"-независимые протеипкиназы 21
1.4.4. Фосфатаза легких цепей миозина (ФЛЦМ) 23
1.4.5. Химические ингибиторы ферментов-модуляторов активности миозина 11.24
2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МИОЗИНА II В СОКРАТИТЕЛЬНОМ АППАРАТЕ ГЛАДКИХ МЫШЩ 26
2.1, Ультраструктура миозиновых филаментов II гладких мышц 26
2.2. Факторы, препятствующие деполимеризации миозиновых филаментов гладких мышц 27
2.3. Особенности регуляции сокращения гладких мышц под действием фосфорилирования РЛЦ миозина 28
2.4, Пермеабилизованные гладкомышечные волокна как модель исследования
регуляции сокращения гладкой мускулатуры 29
3. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ
МИОЗИНА II В НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ 31
3.1. Двигательные реакции в миграции немышечных клеток 31
3.2. Распределение структурных элементов миозина II в мигрирующей клетке 35
3.3. Пространственная регуляция фосфорилирования РЛЦ миозина II в клетке 38
3.4. Экспериментальные подходы к исследованию механизмов миозин II -зависимой подвижности немышечных клеток 40
4. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА KRP (ТЕЛОКИНА) 42
4.1. Структура KRP 42
4.2. KRP как эндогенный регулятор активности миозина II 43
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
1. МАТЕРИАЛЫ 47
1.1 .Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических
исследований 47
1.2.Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований 48
1.3. Реактивы и материалы для физиологических исследований 49
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1 Биохимические методы 49
2.1.1. Определение концентрации белка 49
2.1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН-электрофорез) 49
2.1.3. Мочевинно-глицерольный электрофорез 50
2.1.4. Иммуноблоттииг 50
2.1.5. Приготовление образцов клеток и гладкомышечных волокон для ДСП-электрофореза 51
2. 1. б. Приготовление образцов из гладкомышечных волокон и N1H3T3
фибривластов для мочевиино-глицерольного электрофореза 52
2.1.7. Экспрессия и очисткарекомбинантного KRP и его мутантних форм. 52
2.1.8. Фосфорилирование KRP in vitro 54
2.1.9. Получение KRP, меченого 5-TMRIA 54
2.2. Молекуляржьбиологические методы 54
2.2.1. Создание и характеристика молекулярно-генетических конструкций 54
2.3. Клеточно-биологические методы 55
2.3.1. Культивирование фибробластов линии NIH ЗТЗ 55
2.3.2. Транзиторная трансфекция фибробластов линии N11-1313 56
2.3.3. Получение трансгенных фибробластов линии NIIT ЗТЗ, стабильно экспрессирующих KRP и ACKRP 56
2.3.4. Направленная миграция в камере Бойдена 57
2.3.5. Адгезия фибробластов на иммунологические планшеты, покрытые коллагеном
Ітипа 57
2.3.6 Измерение миграции клеток методом зарастания царапины (Scratch assay). „58
2.3.7. Измерение сократительной активности фибробластов в коллагеновом матриксе 58
2.3.8. Экстракция растворимого миозина из клеток с помощью Тритона Х-100 60
2.3.9. Вычисление линейных параметров ядер и объема фибробластов линии NIII3T3 60
2.4. Физиологические методы 61
2.4.1. Получение препарата taenia caeci, пермеабилизобанного Тритоном Х-100 61
2.4.2. Измерение сократительной активности taenia caeci 61
2.4.3. Приготовление препаратов taenia caeci с меченым KRP для флуоресцентной микроскопии 62
2.5. Количественная обработка изображений и статистический анализ 62
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 64
1, ВЛИЯНИЕ KRP НА СОКРАТИМОСТЬ СКИНИРОВАННЫХ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН 64
1.1. Характеристика скинированных препаратов гладких мыщц taenia caeci 65
1.2 .Влияние KRP на Са2+-независимое сокращение, вызванное микроцистином 67
1.3.Влияние KRP на Са "-зависимое сокращение и расслабление 73
1.3.1. Эффекты полноразмерного и фосфорилированного KRP на расслабление скинированных волокон 73
1.3.2. Релаксирующие эффекты мутантних форм KRP 76
2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ KRP НА МОДЕЛИ
ТРАНСГЕННЫХ КЛЕТОК 79
2.1.Получение и характеристика трансгенных по KRP фибробластов 79
2.2. Влияние KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина в фибробластах 83
2.3. Влияние KRP на количество полимерного миозина II в фибробластах 85
2.4. Роль С-концевого домена KRP в регуляции функционалыюго состояния миозина її в клетках 86
2.5. Влияние KRP на подвижность и сократимость трансгенных фибробластов 88
2.6. С-концевая последовательность KRP необходима для стимуляции хемотаксиса фибробластов 91
2.7. Внутриклеточные эффекты KRP связаны с миозином, регулируемым КЛЦМ и, возможно. Zip-кипазой, но не Rho-киназой 92
2.7.1. Влияние KRP на фосфорилирование миозина при ингибировании кииаз РЛЦ миозина 92
2.7.2. Влияние KRP на двигательные реакции клеток при ингибировании киназ РЛЦ миозина 94
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 96
1. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИОЗИНА II В КЛЕТКЕ ПОД
ДЕЙСТВИЕМ KRP %
2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ KRP ОБУСЛОВЛЕНЫ ЕГО ПРЯМЫМ
СВЯЗЫВАНИЕМ С МИОЗИНОМ 102
3. KRP ПРЕПЯТСТВУЕТ ФОСФОРИЛИРОВАНИЮ РЛЦ МИОЗИНА В КЛЕТКЕ 104
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
