Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Матрично-активированная лазерная десорбционно/ /ионизационная (МАЛДИ) масс-спектрометрия биомакромолекул 11
1.1.1. Общие принципы масс-спектрометрии. Способы десорбции/иониз ации 11
1.1.2. Принцип метода МАЛДИ 13
1.1.3. Масс-анализаторы в МАЛДИ масс-спектрометрии. Времяпролетный (ВП)-анализатор 14
1.1.4. Матрицы для МАЛДИ масс-спектрометрии 19
1.1.5. Качество МАЛДИ масс-спектра и его характеристики 19
1.2. Пробоподготовка белково-пептидных смесей для МАЛДИ МС анализа 27
1.2.1. Общие моменты в пробоподготовке аналитов для МАЛДИ МС анализа 27
1.2.2. Матрицы для МАЛДИ МС анализа белково-пептидных смесей 28
1.2.3. Подготовка белково-пептидных образцов для получения качественных МАЛДИ масс-спектров 32
1.3. Использование МАЛДИ масс-спектрометрии для анализа белков и пептидов 41
1.3.1. Идентификация белков с помощью картирования пептидных масс 42
1.3.2. Обоснование посттрансляционных модификаций белка с известной аминокислотной последовательностью 46
1.3.3. Применение МАЛДИ МС в диагностике 48
1.3.4. Вычислительные инструменты для МАЛДИ МС анализа белков 49
1.3.5. Проблемы МАЛДИ МС анализа продуктов реакций протеолиза 51
1.4. Структура бычьего фибриногена и коллагена типа I. Биохимические подходы к исследованию их протеолиза 56
1.4.1. Бычий фибриноген 56
1.4.2. Коллаген типа I 60
2. Экспериментальная часть 70
2.1 .Материалы 70
2.2. Ферментативный гидролиз коллагена типа I и бычьего фибриногена
2.2.1. Гидролиз коллагена типа I 71
2.2.2. Гидролиз бычьего фибриногена 72
2.3. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 72
2.4. Трипсинолиз белков из геля 73
2.5. Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа 74
2.6. Получение МАЛДИ масс-спектров 75
2.7. Очистка полученных масс-спектров 76
2.8. Обработка очищенных масс-спектров 79
3. Результаты и их обсуждение 85
3.1. Изучение механизма протеолиза бычьего фибриногена МАЛДИ масс-спектрометрическим картированием триптических пептидов высокомолекулярных продуктов реакции 85
3.1.1. Выбор модельного белка 85
3.1.2. Условия получения гидролизатов бычьего фибриногена 94
3.1.3. Подбор условий для получения качественных масс-спектров триптических пептидов фрагментов бычьего фибриногена 95
3.1.4. Исследование механизма протеолиза бычьего фибриногена изоформой СКП-2 с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии 100
3.2. Скрининг коллагеназ при помощи МАЛДИ масс- спектрометрических «фингерпринтов» продуктов протеолиза коллагена типа I 110
3.2.1. Условия получения гидролизатов коллагена типа I 110
3.2.2. Подбор условий для получения качественных масс-спектров гидролизатов коллагена типа I 116
3.2.3. Сравнительный анализ масс-спектров гидролизатов, полученных в результате обработки коллагена типа I ферментами разных классов 129
Выводы 139
