Введение
ГЛАВА1. Материалы и методы исследований
Система Bac-to-Bac для получния рекомбинантных белков в бакуловирусной системе экспрессии
Получение генетических конструкций, кодирующих разные домены десмоглеина 3 человека
Праймеры
Приготовление компетентных клеток для трансформации рекомбинантными векторами
Трансформация клеток Е. coli штамма DH10 Вас векторами, кодирующими разные фрагменты десмоглеина 3 человека
Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli
Трансфекция клеток насекомых линии Sf9 рекомбинантной вирусной бакмидой
Реамплификация вирусного стока.
Определение титра рекомбинантных вирусов.
Выделение белков с исползованием метода Ni -аффиной хроматографии
Электрофорез в полиакриламидном геле
Иммуноблоттинг
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).
Выделение Ig из сыворотки иммунных кроликов и больных вульгарной
пузырчаткой
Выделение фракции IgG из раствора эуглобулинов.
Анализ участия IgG из сывороток иммунных кроликов в акантолизе кожи.
Антитела, использованные в работе.
Приготовление криосрезов из образцов человеческой кожи.
Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов кожи и клеток линий А431 и
НаСаТ
ГЛАВА 2. Получение в бакуловирусной системе экспрессии рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам десмоглеина человека
2.1. Экспрессия генов Д1, Д2, Д1-2 и Д1-5 доменов ДСГЗ в бакуловирусной системе
2.2. Получение рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам ДСГ 3 человека
2.3. Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой
2.4. Идентифиекация В-эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой
2.5. Моделирование конформационных эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой
ГЛАВА 3. Индукция акантолиза антителами к доменам 1-2 и 3-5 ДСГЗ человека
3.1. Получение кроличьих антител к ДСГЗ
3.2. Идентификация эпитопа ДСГЗ, распознаваемого коммерческими моноклональными антителами
3.3. Характеристика клеточных линий кератиноцитов человека.
3.4. Характеристика экспрессии молекул адгезии в неонатальном эпидермисе человека
3.5. Роль антител к различным доменам ДСГЗ в нарушении адгезии между кератиноцитами
3.5.1. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к дистальным доменам Д 1-2 ДСГЗ
3.5.2. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к проксимальным доменам Д 3-5 ДСГЗ
3.6. Связывание антител к ДСГЗ с монослоем кератиноцитов человека линии НаСаТ
ГЛАВА 4. Роль ионов кальция в межклеточной адгезии и ее нарушениях
4.1. Зависимость адгезии в клетках НаСаТ разной степени плотности от ионов кальция
4.1.1. Плотность десмосом на мембранах гиперадгезивных и адгезивных кератиноцитов
4.1.2. Зависимость адгезии в гиперадгезионных клетках НаСаТ от концентрации ионов кальция
4.1.3. Зависимость адгезии в монослое клеток НаСаТ от концентрации кальция
4.2. Роль синтеза десмосомальных кадгеринов de novo в сохранении гиперадгезии клеток НаСаТ
4.3. Роль температуры в сохранении адгезии клеток НаСаТ.
4.4. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция
4.5. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция и комнатной температуре
4.6. Механизм нарушения адгезии между кератиноцитами.
4.7. Различия механизмов действия антител к Д1-2 и ДЗ-5.
4.8. Плотность десмосом на кератиноцитах кожи человека.
4.9. Патогенные антитела к десмоглеину 3 уменьшают число десмосом в супрабазальном слое кератиноцитов кожи
Обсуждение.
Выводы.
Благодарности
Список литературы.
